[发明专利]一种基于PCR技术的染色体步移方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种染色体步移方法，更具体地说，涉及一种利用PCR技术和末端加尾技术来进行染色体步移扩增未知基因或调控元件序列的方法。

背景技术

染色体步移（chromosome walking）是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目的序列的方法和过程。该技术在解决寻找已知基因启动子和调控原件、研究基因内含子和外显子边界、探知特定位点上游和下游序列以及分析外源基因在基因组中插入位点等问题上发挥着关键作用，是一项重要的分子生物学研究技术。但传统的基于基因组文库的染色体步移方法，需要构建庞大、完整的基因组文库，耗时耗力，步骤繁琐，而基于PCR技术的染色体步移方法由于其比较简便快速，得到了广泛的应用，是当前染色体步移方法的主流技术。

由于PCR技术需要依靠上下游两条引物来引导扩增其中间的序列，所以根据在未知序列一端设计引物的策略，目前该技术可分为三类：连接介导的步移方法；随机或简并引物介导的步移方法和加尾介导的步移方法。这些方法都各有优缺点，连接介导法受限于酶切位点分布的随机性或连接效率不高等；随机或简并引物对于一些复杂的模板结合力有限，而且通常需要很低的退火温度，特异性不高；加尾介导方法虽然效率很高但不依赖模板，所以目前使用的都是同聚寡核苷酸引物，如oligo dT、oligo dG，然而oligo dT引物一般都需要较低的退火温度，oligo dG引物的退火温度虽然可以做到和一般的特异性性引物相差不大(Leoni C, Gallerani R, Ceci L R, A genome walking strategy for the identification of eukaryotic nucleotide sequences adjacent to known regions. 2008, 44: 229-235.)，但其很容易结合到DNA模板中的GC富含区，所以此类引物的特异性也不是很强。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术和方法的缺陷，提供一种特异、高效的染色体步移扩增未知基因或调控元件序列方法。

本发明的一种基于PCR技术的染色体步移方法是：以目标DNA序列为模板，在已知序列处设计并合成两条向未知序列端延伸的巢式特异性引物P1和P2，根据P2设计确定互补的P3引物，首先以P1引物引导DNA单链的合成，利用末端加尾酶在合成的单链DNA 3’端先加上多于15个的任意第一碱基，再在第一碱基后加上多于15个非互补的第二碱基；将前述的加尾后的DNA单链为模板，以P2和P3为引物进行扩增。

本发明的基于PCR技术的染色体步移方法中P3引物中寡聚碱基在10～16个之间。

本发明的基于PCR技术的染色体步移方中P3引物中寡聚碱基在在8～12之间。

为达到该目的，本发明所采取的技术方案和步骤如下：依据PCR技术的原理和特性，以目标DNA序列为模板，在已知序列处设计并合成两条向未知序列端延伸的巢式特异性引物P1和P2（见图1），首先以P1引物引导DNA单链的合成（见图2），利用末端加尾酶在合成的单链DNA 3’端先加上多于15个碱基的polyT，后再加上多于15个碱基的polyG（见图3），然而，本发明并不局限于以上这种加尾方式，根据四种碱基互补的特性，凡是先加polyA或polyT，后加polyG或polyC均可以达到相同效果；根据上步加尾的序列设计与其反向互补的P3引物，P3引物中寡聚G或C最好在10～15个碱基之间，寡聚A或T最好在8～12之间，以P2和P3(如5’-CCCCCCCCCCCAAAAAAAAAAA-3’)为上下游引物，以上述加尾后的DNA单链为模板，进行PCR扩增（见图4），将扩增后的产物经TA克隆后进行测序。

本发明与现有技术相比，具有明显的特点和优势：该方法很好的保持了末端加尾法介导的染色体步移方法的优点，如省去了繁琐的酶切和连接步骤，避免了使用随机或兼并引物时易出现的非特性扩增和引物结合力有限等问题。使用5’寡聚C（11C）和3’寡聚A（11A）引物可以结合到模板polyT和polyG末端的中间区域，既具有正常的引物退火温度，又避免了引物3’端非特异性结合到模板的GC富含区，所以该方法所获得的步移产物，其特异性更强、步移距离也较长。通过对该方法的两次实施结果表明其适合于扩增外源基因在哺乳动物细胞基因组中的插入位点，这说明该方法在鉴定转基因动物中外源基因插入位点方面有十分广阔的应用前景。

附图说明