[发明专利]一种靶向整合素受体的新型多肽修饰的肿瘤靶向脂质体

说明书

技术领域

本发明涉及药物制剂技术领域，特别涉及一种肿瘤靶向的脂质体给药系统，该系统是将环状的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列与细胞穿膜肽（CPP）相连，得到一种同时具有整合素受体靶向性及高效介导入胞能力的新型多肽，并修饰于脂质体表面得到的一种肿瘤靶向脂质体。 

  

背景技术

脂质体作为一种常用的药物载体，具有生物相容性好，能够增加药物疗效，降低药物毒性，表面易于进行配体修饰等优势，可以作为各种治疗药物的传递载体，在普通脂质体的表面修饰亲水性的聚乙二醇（PEG）后可制得长循环脂质体，显著增强其在体内的循环时间，并通过EPR效应被动蓄积至肿瘤组织；而在脂质体表面修饰特异性的配体或抗体等，能够使脂质体获得主动靶向性。 

整合素（Integrins）是一类细胞黏附受体分子，在所有的有核细胞表面均广泛表达，其在体内能够介导细胞与细胞之间，以及细胞与细胞外基质的相互黏附。整合素是由α和β亚基通过非共价键结合形成的异二聚体，在脊椎动物体内，整合素有18种α亚基和8种β亚基，其可以组成约24种不同的异二聚体结构。其中整合素αvβ3在神经胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌等多种肿瘤细胞及肿瘤相关的内皮细胞表面高度表达，与肿瘤的血管发生，肿瘤转移及肿瘤的抗放射治疗密切相关，因此整合素αvβ3常被用作肿瘤靶向的特异性靶点。 

已有研究表明，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp, RGD）的三肽序列能够特异性地识别含αv亚基的整合素家族，进一步的研究也已证实，具环状结构的RGD能够显示出和整合素αvβ3、αvβ5的高度亲和力，其与整合素αvβ3的亲和力约为线性RGD的1000倍。 

细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides, CPP）是一类能够通过能量依赖性途径跨膜转运进入细胞的短肽，一般不超过30个氨基酸。常见的CPP包括源于Tat蛋白碱性结构域的短肽TAT，多聚精氨酸等。CPP具有帮助本身不具备细胞膜穿透能力的生物大分子进入细胞的能力，因此其可以作为一种有效的运输载体，迄今已有许多利用细胞穿膜肽成功地将多肽、蛋白质、基因等大分子导入细胞内的研究报道。但CPP同样存在一定缺陷，即不具备组织特异性，有研究通过CPP的聚乙二醇化实现其在体内的长循环，并通过肿瘤组织的EPR效应实现被动肿瘤靶向，但我们仍希望能够通过某种手段实现高效的主动靶向效应。 

  

发明内容

本发明的目的之一是提供一种同时具有上述特异性配体RGD与非特异性配体穿膜肽的作用的多肽，并修饰于长循环脂质体的表面，用以提高脂质体的靶向性。 

本发明的目的之一是提供一种具整合素受体靶向能力的多肽，所述多肽是由特异性配体环状RGD与细胞穿膜肽(CPP)通过肽键共价连接；其同时拥有RGD的特异性识别功能以及CPP的高效介导入胞能力。 

本发明所述的新型多肽是具有CPP-环(RGD)结构（即，CPP-环状RGD或CPP-环RGD）的多肽。其中，前端的环(RGD)片段是含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的任何具环状结构的多肽片段，包括含RGD序列的环三肽、环四肽、环五肽、环六肽、环七肽、环八肽、环九肽和环十肽，最优选的是环五肽；后端的CPP包括但不限于，人免疫缺陷病毒蛋白转导肽TAT、1-型单纯疱疹病毒间层蛋白VP22、三聚精氨酸R3、四聚精氨酸R4、五聚精氨酸R5、六聚精氨酸R6、七聚精氨酸R7、八聚精氨酸R8、九聚精氨酸R9、十聚精氨酸R10、十一聚精氨酸R11、十二聚精氨酸R12、源于果蝇触角基因同源结构域的十六肽Penetratin、由神经肽galanin和黄蜂毒素连接的拼接肽Transpotan等。 

所述环(RGD)与CPP之间可仅由肽键相连，也可通过一个或多个氨基酸构成的桥联基团连接。 

本发明的目的之一是提供了一种制备CPP-环(RGD)的方法，包括以下步骤： 

（1）取2-CL-Trt Resin树脂置固相反应器中，加入二氯甲烷(DCM)溶胀30min，然后抽干DCM；

（2）称取N端用芴甲氧羰基(Fmoc)保护的序列中的第一个氨基酸，即精氨酸，加入溶胀好的树脂中，加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、二甲基酰胺(DMF)，DCM氮气鼓泡室温反应2.5小时，反应后抽干反应液，加入乙酸乙酯洗净，再加入20%六氢吡啶/DMF溶液去除Fmoc保护基，去保护基后加入乙酸乙酯洗净；