[发明专利]特异性识别胃癌细胞的DNA适配子GCA-5及其应用

说明书

技术领域

    本发明涉及基因工程领域,具体是一种特异性识别胃癌细胞的DNA寡核苷酸适配子GCA-5的序列和修饰，以及修饰后的GCA-5在识别胃癌细胞方面的应用，包括用于临床胃癌组织标本的辅助诊断、胃癌分子靶向诊断、胃癌生物导向治疗，基础研究中胃癌细胞的分离、纯化和鉴定，以及胃癌肿瘤标志物的识别和鉴定。

背景技术

已证实，胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，严重威胁人类生命健康。尽管早期胃癌的治疗效果较好，但诊断率低；由于胃癌早期的临床表现缺乏特异性，多数胃癌患者确诊时已属进展期，手术及放化疗效果都不理想。可见，胃癌的预后主要依赖于分期，其诊断和治疗的重点是早期。目前，早期胃癌诊治的主要手段（金标准）仍然是内镜活检和内镜粘膜下切除术（Yada T,et al.Diagn Ther Endosc 2013;2013:241320）。然而，这需要特殊的仪器设备、较高的费用和施术者的经验积累，患者的耐受性和依从性也难以保证，因而仍然面临普及难和不易实现早发现、早诊断的问题。因此，更可靠、更方便、更廉价和更容易普及的胃癌诊治手段亟待发现和制备应用。

近年来，众多的高通量生物技术方法不断涌现，其中细胞-SELEX技术可筛选特异性结合于细胞的核酸适配子，这为肿瘤的早期诊断和治疗提供了新的可能。SELEX是指数富集的配基系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）的英文缩写，利用该技术通过多次反复的扩增和筛选循环，可以从随机单链DNA或RNA库中获取特异性结合于靶物质的核酸序列，称为适体（aptamer）或适配子；适配子具有精确识别、高特异性、高亲和力结合靶标等特性，且容易在体外合成和修饰、理化性质稳定、费用低廉、获取周期短等优势。随着SELEX技术本身的不断发展以及靶标范围的不断拓展，近年出现了以活细胞为靶标进行的SELEX筛选，即细胞-SELEX（cell-SELEX或cell-based SELEX）技术（徐发良,等.第二军医大学学报2012;33:432-435）。通过细胞-SELEX筛选而获得的适配子，可用于肿瘤细胞的富集与检测、肿瘤诊断、靶向治疗和肿瘤标志物研究（Fang X, et al. Acc Chem Res 2010;43:48-57）。我们利用细胞-SELEX的筛选原理和实验方法（Sefah K, et al. Nat Protoc 2010;5:1169-1185），以胃癌细胞株为阳性筛选细胞、以正常胃粘膜细胞为对照细胞，建立了筛选肿瘤细胞DNA适配子的方法；该技术的一个显著优势在于，研究者无须事先明确肿瘤细胞特定的靶分子，就可以筛选出特异性结合于肿瘤细胞的适配子。借助蛋白质组学的技术，可对适配子结合的靶标进行分离、鉴定，进而成为潜在的肿瘤标志物。

 

发明内容

本发明的目的是提出特异性识别胃癌细胞的DNA适配子GCA-5, 以及修饰后的GCA-5在识别胃癌细胞方面的应用，包括用于临床胃癌组织标本的辅助诊断、胃癌靶向诊断、基础研究中胃癌细胞的分离、纯化、鉴定和胃癌的生物导向治疗。

本发明是结合了国内外的研究进展以及发明人自身的工作积累，以胃癌细胞株为靶标、以正常胃粘膜为消减靶标，通过成功建立细胞-SELEX技术筛选到一个适配子GCA-5（gastric cancer aptamer）。经鉴定，GCA-5能特异性识别并结合胃癌细胞株，而不与正常胃粘膜细胞及结肠癌细胞株结合；尤其重要的是，GCA-5也能特异性识别并结合来自临床胃癌手术标本的癌细胞；而对照核酸序列与上述细胞均无结合。这对于胃癌的临床辅助诊断、分子靶向诊断和生物导向治疗中所需试剂盒和药物的制备具有重要意义。由于经过FITC或TAMRA标记的GCA-5可以直接用于荧光方法检测肿瘤细胞，其操作比传统的免疫学方法更简单。另外，GCA-5可能通过特定的靶标分子结合于胃癌细胞，从而在胃癌细胞的分离、纯化和鉴定，以及胃癌肿瘤标志物的鉴定方面得到应用。因此，本发明可以在临床医学和基础医学中得到广泛应用。

为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的，一种特异性识别胃癌细胞的DNA适配子GCA-5的核苷酸序列为:SEQ  ID  NO.1。

进一步可以再在所述核苷酸序列SEQ ID NO.1的5’端标记荧光素（如FITC、TAMRA等）或酶类物质(生物素和地高辛)等，并通过荧光检测设备、链亲和素标记的辣根过氧化物酶检测系统和抗地高辛抗体标记的碱性磷酸酶检测系统，对胃癌细胞进行示踪、定位和检测。

上述核苷酸在制备靶向定位胃癌细胞的试剂盒中的应用。