[发明专利]用改变fbp酶调控元件的细菌发酵生产L-色氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及发酵生产l-色氨酸的方法及其衍生的方法和应用，和可以用在这些方法和应用中的多核苷酸、载体和细菌。

背景技术

通过产l-色氨酸的细菌（如，埃希氏菌属的大肠杆菌和棒杆菌属的杆状细菌）发酵来生产l-色氨酸已经得到了产业化应用。这些细菌，可以是从自然界分离的细菌，也可以是通过诱变或基因工程改造获得的细菌，或者两者兼而有之。当前的文献报道中，通过基因工程改造的注意力主要集中在mtr、aroP、tnaA、trpB、gnd以及traB等基因上（参见中国专利85101270、93117586、96111972、200580043246、200710056966、201010598350等），未见为了L-色氨酸生产而关注fbp酶及其编码基因，更未见对fbp酶的调控元件加以改造，事实上国际专利WO2007039532甚至在没有任何实验依据的情况下，就下结论在生产诸如赖氨酸和色氨酸的方法中，需要进一步表达fbp酶。

Fbp酶由fbp基因编码。在E. coli K12菌株及其衍生菌株（如，W3110菌株）等中，野生型的fbp基因的核苷酸序列如Genbank登录号AP009048.1中第4459291-4460289位所示，本发明人发现其上游具有调控（尤其是启动子）功能的序列（野生型的调控元件序列）如SEQ ID No：1所示，通过Genbank提供的同源性比较工具，也能够找到其他野生型的fbp基因的上游调控元件。

本发明人经过长期研究和实践，尤其凭借了一些运气，偶然发现fbp基因的上游调控元件的改造能够有助于提高l-色氨酸的产量，而且本发明人发现，fbp基因的调控元件不能简单地提高或敲除，尤其是敲除后将使得细菌生长困难，难以实际应用，因此开发了新的针对fbp基因的调控元件的方法，以此来提高l-色氨酸的产量，而且更重要的是，该方法与现有改造的大量高产L-色氨酸的细菌的染色体改造位点没有冲突，可以叠加提高的效果，从而在实践上可用于细菌发酵生产l-色氨酸。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵生产l-色氨酸的方法及其相关的方法，包括相对于未改造细菌提高l-色氨酸的发酵生产量的方法，改造的细菌在发酵生产l-色氨酸中的应用，改造的细菌在相对于未改造细菌提高l-色氨酸的发酵生产量的应用，和/或，改造细菌的方法等。另外，本发明还提供了可以用于上述方法中的多核苷酸、载体和/或细菌等。

       具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵生产l-色氨酸的方法，其包括：

（1）改造细菌染色体上fbp基因的野生型的调控元件，使改造获得的细菌的该调控元件对其下游酶基因的表达启动能力减弱但不消失；和，

（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产l-色氨酸。

       在本文中，术语“改造”指的是是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果。改造位于染色体上的基因的手段包括但是不限于，诱变、定点突变、和/或同源重组，优选是后两者。这些技术手段广泛记载于分子生物学和微生物学文献中，有许多甚至已经商品化了。在本发明的具体实施方式中，根据同源重组的原理，采用Addgene公司商品化的pKOV质粒系统来进行改造，将未改造细菌染色体上fbp基因的野生型的调控元件，改造成能够使改造获得的细菌的该调控元件对其下游酶基因的表达启动能力减弱但不消失的新的调控元件。因此，在本文文中，优选改造是通过同源重组进行的改造。

在本文中，术语“下游酶基因”指的是fbp基因的野生型的调控元件所能调控的编码酶的基因，而且该酶位于该调控元件的下游。所以，该调控原件一般是启动子。优选在本文中，下游酶基因是fbp基因。