[发明专利]三七及屏边三七病程相关功能基因的克隆

说明书

技术领域

本发明涉及利用RT-PCR技术克隆三七及屏边三七病程相关功能基因的一种技术。

背景技术

植物病害是农业生产当中所面临的一种主要限制因子，药用植物在其栽培过程中也同样面临着一样的问题。植物受到病害感染之后，常常表现为严重的连作障碍问题、产量剧减、药用有效成分降低及品质变劣等一系列问题。

三七[Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen]为五加科人参属植物，又称“南国神草”、“金不换”等，是我国重要的名贵中药材之一。三七属于块根入药，有显著的止血、活血化淤、消肿定痛之功效，其使用历史已有近600年。李时珍《本草纲目》记载：三七性温、微苦、味甘、归肝、肾、胃经，具有止血化瘀、消肿定痛之功，能治一切血病。

三七属于栽培驯化较早的中药材之一，至今为止其人工栽培历史已有400多年。而这种长期的、规模化的栽培使得三七在自身种植中暴露出很多问题，主要表现为品质降低、产量不稳定、极易感染病虫害等等。

屏边三七[Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng]亦是人参属植物，为三七近缘植物物种之一，又名“野三七”、“香刺”、“土三七”等。据三七研究院孙玉琴等老师们长期的观察发现：在同样的生长及栽培环境条件下，发现屏边三七表现为极少感病，基本上对三七病害免疫。这就为三七抗病基因的挖掘、开发利用提供了可能。

最近的几年里，人们克隆到了多个植物抗病基因使得对寄主与病原相互作用分子机理的研究得到迅速的发展。植物在生长发育过程中常受到一些病原物的侵袭，表现为抗病或感病，在长期的相互作用及相互选择、协同进化的过程中，植物逐渐获得了一些列复杂的防御机制来保护自己。这些机制包括植物细胞对病原菌的识别，胞内信号的转换与传导，防卫反应的开启与系统获得抗性的形成。植物体最终会表现为产生加固和阻止病原生长的细胞壁成分；合成小分子抑菌物质如植保素(phytoalexin)，毒性酚类小分子化合物；诱导产生各种病程相关蛋白(pathogenesis related，PR蛋白)如几丁质酶、葡聚糖酶等；蛋白酶抑制剂的生成；释放各种活性氧；诱导植产生物内原激素等等一系列复杂的生化过程。

因此，对植物抗性基因的克隆成为当前研究的热点。自1992年第一个植物R基因Hm1被克隆以来，越来越多植物中的R基因被克隆。在植物抗病基因的克隆工作中，图位克隆(positional cloning，map-based cloning)和转座子标记技术(transposon tagging)是常用的两种技术。如玉米抗圆斑病基因Hm1，番茄抗叶霉病基因Cf-9，Cf-4，烟草抗烟草花叶病毒基因N，亚麻抗叶锈基因L6和M等均是利用转座子标记技术克隆到的抗病基因。大麦抗白粉病基因Mlo，番茄抗叶霉病基因Cf-2，抗叶斑病基因Pto和Prf基因、抗枯萎病基因I2，拟南芥抗丁香假单胞杆菌基因RPS2、RPM1，水稻抗白叶枯病基因Xa21、Xa1、抗稻瘟病基因Pib均是利用图位克隆技术得到。然而，转座子标签法需要筛选并鉴定突变体、工作量较大、加之插入位点的不确定性也大大地限制了在其他植物上的应用；图位克隆法则要求有高密度的分子标记图谱，而药用植物中大都存在有遗传背景不清、分子标记缺失等问题，这些问题的存在使得想要利用图位克隆技术研究相关基因变得比较困难。

从已被克隆R基因来看，虽然这些R基因针对不同的细菌、真菌、病毒和线虫，但它们的产物却具有着令人惊奇的结构相似性。而且抗性基因常常以基因家族(family)的形式出现，不同植物中的同类基因之间具有着较高的保守性。这对于那些使用常规基因克隆技术困难的植物来说，提供了一种克隆抗性基因的途径。本发明通过使用三七近缘属植物人参、西洋参EST数据，经序列拼接、基因功能注释、KEGG作图，最后成功地克隆出三七和屏边三七中部分病程相关功能基因，这些基因在其他药用植物研究当中还没有相关报道。

发明内容

本发明提供了一种三七病程相关功能基因克隆的方法。

本发明提供了一些病程相关功能基因，它是下列核苷酸序列之一：

序列表中R ID No.1的DNA序列；

与序列表中R ID No.1限定的DNA序列具有一个或几个碱基突变，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。