[发明专利]一种检测氨基甲酸酯类的酶抑制法

说明书

技术领域

本发明涉及化学领域，具体涉及一种检测氨基甲酸酯类的酶抑制法。 

背景技术

氨基甲酸乙酯 (Ethyl Carbamate，简称EC)是发酵酒在发酵及贮存过程中天然产生的污染物。EC早在1943年就被证实为致癌物质。研究表明，对啮齿类动物，EC是一种多位点致癌物，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病。2007年，国际癌症研究所把EC对人类的致癌毒性归为2A类。目前氨基甲酸乙酯的污染，被认为是食品中继黄曲霉毒素之后的又一重要问题。 

酶抑制法是研究最多且相对成熟的一种对有机磷、氨基甲酸乙酯类农药进行快速检测的技术。该法检测有机磷和氨基甲酸乙酯类农药具有快速、简便、灵敏、低成本等优点，已经成为国内外快速检测农药残留的主流技术。但是，在这些文献中，其所检测到的氨基甲酸酯类物质非常有限，如GBT 18630-2002和GBT 5009-2003中分别提到采用酶抑制法检测到西维因（1.0mg/kg）、呋喃丹（0.5mg/kg）、抗蚜威（0.3mg/kg）、甲萘威（2.5mg/kg），其他文献中也有涉及易索威、扑灭威、速灭威、涕灭威等，但都没有提到氨基甲酸乙酯。由于氨基甲酸酯类物质种类繁多，性质各异，因而酶抑制法并非适用于检测所有的氨基甲酸酯类物质。 

此外，由于氨基甲酸酯类对酶的抑制具有专一性，需要找到合适的酶及相应的底物、显色剂进行酶反应。而氨基甲酸乙酯是一种结构相对简单的氨基甲酸酯类，试验表明，高浓度的氨基甲酸乙酯对乙酰胆碱酯酶无抑制作用。因此，需要对其进行前处理，提高其抑制率，降低检测限，使该法具有实际应用意义。 

发明内容

本发明的目的之一在于，提供一种检测氨基甲酸酯类的酶抑制法。 

本发明的另一个目的在于，提供一种检测氨基甲酸乙酯、氨基甲酸丙酯、氨基甲酸丁酯等多种含氨基结构的氨基甲酸酯类物质的酶抑制法。 

发明通过以下技术方案实现上述目的。 

首先，发明提供了一种氨基甲酸酯类的酶抑制法，所述的酶为乙酰胆碱酯酶；采用碘化硫代乙酰胆碱作为酶解底物，采用二硫代二硝基苯甲酸作为显色剂。 

优选地，所述的氨基甲酸乙酯类为氨基甲酸乙酯氨基甲酸丙酯、氨基甲酸丁酯等多种含氨基的氨基甲酸酯类物质。 

尤其优选的是，所述的氨基甲酸乙酯在对乙酰胆碱酯酶进行抑制前，还先经过氧化剂的处理进行氧化。 

所述的氧化剂为次氯酸钠、次氯酸钙、溴水、溴酸钠、氯酸钠、双氧水、溴水-氢氧化钠溶液中的一种或多种。

所述氨基甲酸乙酯经氧化后，需用过量的还原剂还原。 

具体地将，所述方法包括以下步骤： 

S1. 预处理：将含有氨基甲酸乙酯的待测目标采用氧化剂进行氧化后，再进行还原；

S2. 在S1预处理产物中，加入乙酰胆碱酯酶和碘化硫代乙酰胆碱，进行反应；

S3. 在S2反应产物中，加入二硫代二硝基苯甲酸进行显色。

更具体地，包括以下步骤： 

S1. 预处理：在含有氨基甲酸乙酯的待测目标中加入溴制剂，氧化5—30min后（优选10—25min），用5-15%亚硝酸钠溶液还原；

S2. 在S1预处理产物中，加入乙酰胆碱酯酶，25—40℃反应10—30min；

S3. 在S2反应产物中，加入二硫代二硝基苯甲酸和碘化硫代乙酰胆碱，显色后在波长405-415nm下测定吸光值；优选412nm。

其中的乙酰胆碱酯酶、二硫代二硝基苯甲酸、碘化硫代乙酰胆碱和溴的用量比为1~3： 1~3：1~3：1~3。 

优选地，乙酰胆碱酯酶浓度为10-15mg/ml，用量为50-150ul；二硫代二硝基苯甲酸浓度为5-10mg/ml，用量为50-150ul；碘化硫代乙酰胆碱浓度为5-10mg/ml，用量为50-150ul；溴水的浓度为3-10%，用量为50-100ul。 

其中的溴制剂和亚硝酸钠的用量比为体积比1：1～1：5。 

优选地，上述所采用的亚硝酸钠溶液的质量分数为5—15%（优选7—12%）。 

优选地，溴制剂为溴水，或溴水-氢氧化钠溶液。可选地，溴水的质量分数为3%~10%；所述的溴水的浓度为质量分数3%~10%；溴水-氢氧化钠溶液中，溴的质量分数为2%~10%，氢氧化钠的浓度为0.003mol/L~0.3mol/L。