[发明专利]哈维氏弧菌巨噬菌体VP4B及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体是巨噬菌体及其应用。 

背景技术：

细菌性感染是感染疾病中最常见的类型，过去几十年里抗生素被认为是治疗细菌感染的最好方法。但是随着近年来抗生素滥用现象日益严重，细菌的耐药性问题日益加剧，人们把选择其他抗菌剂的目光转移到噬菌体上。相较传统的抗生素，噬菌体的优势在于对宿主菌有高度专一性，能够持续自我繁殖，对抗药菌株具有再侵染能力，对环境没有污染，无刺激。 

随着生物技术的发展，噬菌体的地位越来越重要。对噬菌体的基因进行研究，不仅为噬菌体的多样性和进化途径提供了资源，也为噬菌体的生物学特性和其与宿主之间的相互作用提供了证据，同时也为噬菌体治疗的安全性和可控性提供了保障。 

发明内容：

本发明的目的在于提供一种巨噬菌体VP4B及其应用。 

为了实现本发明的目的，发明人利用双层平板分离纯化、基因组提取和核酸序列测定等技术对从环境中得到噬菌体VP4B，对其进行基因组核酸序列的测定和分析，发现其基因组序列全长246,964bp， GC含量为43.29％，含有210个预测的ORF。发明人于2013年5月9日将该噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)，保藏号CCTCC NO：M2013192，其分类命名为哈维氏弧菌噬菌体VP4B(Vibrio harveyi Phage VP4B)。 

本发明的巨噬菌体VP4B可用于噬菌体功能基因组学、新型病毒载体构建、进行弧菌病害的预防和快速诊断，以及噬菌体吸附、侵染、裂解弧菌机制的研究。 

根据后面的实施例，本发明中的巨噬菌体VP4B是裂解性噬菌体，能够侵染哈维氏弧菌，在弧菌体内复制增殖之后，能够裂解哈维氏弧菌的细胞壁，致使弧菌裂解死亡。可以有效的控制哈维氏弧菌的数量及增殖速度，可以用于水产养殖中哈维氏弧菌病害的防治。在具体实施方式中，本发明的巨噬菌体VP4B能够明显的抑制哈维氏弧菌生长速度和浓度。 

本发明可以根据巨噬菌体的抑菌曲线来对于水产养殖中的弧菌，特别是哈维氏弧菌，进行病害防治以及病害防治酶材料的开发应用。 

本发明还提供了包含本发明的巨噬菌体的细菌。优选地，所述细菌是哈维氏弧菌。 

本发明还提供了一种产生巨噬菌体的方法，所述方法包括在细菌中培养本发明的巨噬菌体的步骤。在一个实施方案中，所述细菌是哈维氏弧菌，例如德国微生物菌种保藏中心以保藏号：DSM-6904保藏的细菌。 

附图说明：

图1为哈维氏巨噬菌体VP4B抑制哈维氏弧菌生长OD曲线图。 

具体实施方式：

1.噬菌体的收集和浓缩 

(1)向200mL液体2216E培养基(1g酵母粉，5g蛋白胨，0.01g磷酸高铁，1L陈海水)的三角瓶中添加0.1mL哈维氏弧菌(购自DSMZ，保藏号：DSM-6904)溶液，并向所述三角瓶中添加0.1mL本发明的哈维氏巨噬菌体VP4B(保藏号：CCTCC NO：M2013192)溶液，置于37℃培养箱，摇瓶培养18小时。向培养后的液体中加入酶抑制剂苯甲基磺酰氟PMSF使其终浓度为1mM，以15000×g进行20min的离心。 

(2)取上清加入NaCl，使其终浓度为1M；加入聚乙二醇PEG6000(Sigma，25322-68-3)，使其终浓度为10％，在4℃下放置1-3h。 

(3)以15000×g在4℃下离心1h。 

(4)去上清，用2mL的SM缓冲液(Amrecso，J614-500ML)重悬，以3000×g进行15min离心，去沉淀。 

(5)将离心上清液在氯化铯溶液(1.5g/mL)中，以220000×g在4℃下离心24h。 

(6)用一次性针筒收集噬菌体。 

2.噬菌体基因组的提取 

(1)在上述步骤1中制备的1mL噬菌体颗粒悬浮液中加入 DNase/RNase混合物(Takara，2210CA/R0675)(终浓度为2mL/L)，混合均匀，在37℃的水浴中孵浴45min。 

(2)加入150μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH＝8.0)和30μL10％(w/v)SDS溶液，上下颠倒，在70℃的水浴中孵育10min。 

(3)加入125μL乙酸-乙酸钾缓冲液(pH4.3)，在冰水浴中孵育30min-1h。 

(4)以14,000×g在4℃下离心15min。