[发明专利]一种鸡载脂蛋白AⅡ的分离纯化及鉴定方法

权利要求书

1.一种鸡载脂蛋白AⅡ的分离纯化及鉴定方法，其特征在于它的分离纯化方法为：（1）鸡血清的收集：翅下静脉采血，采血后，拿去针头，轻轻注入试管中。

2.为防止血细胞的破裂，清洗干净和消毒好的注射器和试管预先用0.85%生理盐水浸润，防止血凝块与玻璃管壁粘连，造成血清析出不良。

3.试管45°角静置37℃温箱1 h，再置4℃冰箱内静置3～4 h，待血液凝固血块收缩后用毛细滴管吸取血清，再以1000×g离心10 min，取上清血清分装后置-20℃冰箱中加NaN₃保存备用；

（2） HDL粗品的制备--磷钨酸沉淀法：取血清1.0 ml加入1.0 ml沉淀剂Ⅰ，混匀，静置10 min，1000×g离心15 min，吸出上清约1.8 ml加入0.42 ml沉淀剂Ⅱ，混匀，静置5 min，1000×g离心10min弃上清，沉淀溶于0.1 ml 12% NaCl 及1.0 ml 0.02mol/L Tris-HCl液中，加入0.26 ml沉淀剂Ⅱ静置5 min，1000×g离心10min弃上清，对沉淀进行重复溶解，沉淀和再溶解过程一次，最后得到含有HDL的粗制品溶液；

（3） HDL粗制品的脱脂：将所制得HDL溶液在不断搅拌有机溶剂的情况下，用移液枪缓慢滴入待脱脂的HDL溶液，HDL溶液逐滴加入于60 ml丙酮/乙醇，体积比为1：1混合液中，-20℃脱脂2.5h，1000×g离心15 min弃上清，再同样条件下再脱脂一次，-20℃冰箱中2.5 h后1000×g离心15 min弃上清，最后加入50 ml乙醚脱脂2.5 h离心弃上清所得白色沉淀为脱脂后HDL制品；

（4）脱脂HDL的溶解：将脱脂后的HDL溶于100ml 6mol/L尿素-10mmol/L Tris-HCl-10mmol/L二硫苏糖醇溶液中，4℃过夜；

（5）脱脂HDL溶液的透析和浓缩：将上述HDL溶液对6mol/L尿素-10mmol/L Tris-HCl -1mmol/L EDTA pH:8.0溶液进行透析，以除去其中的有机溶剂，之后用50%的聚乙二醇6000浓缩至2～3 ml以提高HDL溶液的浓度；

（6）载脂蛋白AⅡ的提取：DEAE Sepharose CL-6B 柱层析：柱床体积1.5×40 cm ，DEAE Sepharose CL-6B装柱后用0.03 mol/L Tris-6 mol/L溶液平衡，样品约10ml上柱后，先用相当于两倍床体积的0.03 mol/L Tris-6 mol/L洗柱，然后用0～0.5 mol/L NaCl进行梯度洗脱，洗速1 ml/min，每管收集6 ml，梯度液成分：A液0.03 mol/L Tris-HCL-6 mol/L Urea 500 ml，B液：280 nm紫外检测仪检测，流速3 ml/h ，6ml每管部分收集，合并各峰顶附近几管，用蔗糖进行浓缩后-20℃冰箱贮存待分离；Sephadex G-150柱层析：上述方法准备Sephadex G-150层析柱，之后将过DEAE Sepharose CL-6B后含有apoAⅡ的蛋白溶液2～3 ml加至凝胶柱的上方，待蛋白液与胶体齐平后用洗脱液进行洗脱，流速9 ml/h，每管3 ml，280 nm紫外检测仪检测，合并各峰顶附近几管，用蔗糖进行浓缩后-20℃冰箱贮存待分析。

4.根据权利要求1所述一种鸡载脂蛋白AⅡ的分离纯化及鉴定方法，其特征在于它的鉴定方法方法为：采用Urea-SDS-PAGE电泳对apoAⅡ纯度进行鉴定：分离胶：T=15%、C=2.6% pH:8.8，水用8mol/L的尿素代替；浓缩胶：T=5% C=2.6% pH:6.8，电极缓冲液1L中含有3g Tris，14.4g 甘氨酸，1g SDS，pH:8.3，开始电泳时浓缩胶使用160V稳压，进入分离胶后使用320V稳压，当溴酚兰迁移带到达电泳槽底部时，关闭电源，小心取出电泳胶后在预热60℃的0.1%考马斯亮蓝R-250染色液中染色10min，随之用脱色液多次更换加热脱色至背景干净为止。

5.根据权利要求1所述一种鸡载脂蛋白AⅡ的分离纯化及鉴定方法，其特征在于所述沉淀剂Ⅰ是将磷钨酸0.44g，MgCl₂·6H₂O 1.1g，1mol/L NaOH 1.3ml，双蒸水加至100ml，混匀，调节pH为6.2。