[发明专利]磁性Fe3O4@SiO2-NH2纳米微球固定化海洋脂肪酶Bohai Sea-9145的方法

说明书

技术领域

本发明涉及海洋微生物领域，特别是涉及磁性Fe₃O₄@SiO₂-NH₂纳米微球固定化海洋脂肪酶Bohai Sea-9145的方法。 

背景技术

脂肪酶（EC3.1.1.3），是一类主要催化细胞内外甘油和长链脂肪酸水解、酯合成反应的羧基水解酶，是一种通过反应将底物降解形成游离脂肪酸和甘油的界面酶。它属于一类水解酶（E.C.3），作用于羧酸酯（E.C.3.1）的酯键(E.C.3.1.1)上，能够水解甘油三酯，甘油二酯和甘油单酯，并称为三酰甘油酰基水解酶（E.C.3.1.1.3）。脂肪酶的催化反应范围广泛，能够催化进行包括水解，酯交换，醇解，酸解，酯化和氨解在内的多种生物化学反应。脂肪酶对多种底物都能够起到区域选择性合成、对映体催化的作用。 

海洋环境中嗜冷微生物所产生的脂肪酶，在低温下能够高效的进行催化水解反应，而普通的嗜温微生物在低温条件下仅能表现出很少的活性。这些脂肪酶在结构功能上具备更高的灵活性，特别是其活性位点的特殊性赋予了低温脂肪酶低活化焓，低底物亲和力和低温下的高比活性。 

游离酶催化反应是在溶液中进行的，一般来说稳定性差，容易失活、不溶于有机溶剂，易受环境等因素的影响。固定化酶是通过适当的方法将酶固定在一定的空间内，在保持其自身特性的同时能够实现回收和重复利用。固定化酶的出现解决了游离酶实际应用中的诸多局限，游离酶稳定性较差,脂肪酶分离纯化困难等问题，限制了海洋脂肪酶的利用。 

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在诸多不足，经发明人长期开发研究海洋微生物及其酶产物和生产实践,开发提供一种固定化体系稳定，酶活率保留高的磁性Fe₃O₄@SiO₂-NH₂纳米微球固定化海洋脂肪酶Bohai Sea-9145的方法。 

本发明提供的磁性Fe₃O₄@SiO₂-NH₂纳米微球固定化海洋脂肪酶Bohai Sea-9145的方法,包括下列步骤： 

将磁性Fe₃O₄@SiO₂-NH₂纳米微球置于容器（如西林瓶）中，再向容器中加入酶蛋白浓度为0.0375一0.225mg/ml、pH4.0-10.0的海洋脂肪酶Bohai Sea-9145溶液,在摇床上进行固定化反应,固定化反应温度为20-50℃,固定化反应时间为4-20小 时，然后进行磁性分离，收集上清液，用于测定蛋白含量，清洗固定化海洋脂肪酶Bohai Sea-9145，直至清洗液中无蛋白含量吸收，得固定化海洋脂肪酶Bohai Sea-9145。 

本发明提供的磁性Fe₃O₄@SiO₂-NH₂纳米微球固定化海洋脂肪酶Bohai Sea-9145的方法中,所述海洋脂肪酶Bohai Sea-9145（海洋脂肪酶Bohai Sea-9145的编号以区别其它低温碱性脂肪酶,下文简称脂肪酶Bohai Sea-9145或脂肪酶）是由适冷性海洋酵母菌株Bohai Sea-9145发酵培养产的脂肪酶,是一种海洋低温脂肪酶。该海洋脂肪酶Bohai Sea-9145对于中长链的酯类底物有较强的水解作用，在低温环境中能够保持较好的脂肪酶活性，同时作用pH和温度范围较广，显示出良好的酶学特性。 

所述适冷性海洋酵母菌株Bohai Sea-9145是从渤海海域海泥中分离获得的高产低温碱性脂肪酶Bohai Sea-9145（海洋脂肪酶Bohai Sea-9145）的适冷性海洋酵母菌株Bohai Sea-9145，根据第四版《The Yeasts,A Taxonmic study》，（Kurtzman&Fell,1998）确定为适冷性海洋解脂耶罗氏酵母菌株（Yarrowia lipolytica strain）一个新的亚种，该适冷性海洋酵母菌株Bohai Sea-9145于2003年11月26日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏号为CCTCCNO：M203095。