[发明专利]一种快速检测水产品中甲基睾丸酮的胶体金试剂板

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测甲基睾丸酮的胶体金试剂板，具体涉及一种快速检测水产品中甲基睾丸酮的免疫胶体金快速检测试剂板。

背景技术

甲基睾丸酮(methyltestosterone，MT)是一种合成类固醇，属于蛋白同化激素，具有雄性和蛋白同化双重作用。但其在水产品中的残留严重威胁人体健康。大量实验表明，甲基睾酮代谢时间长，对人类的危害是慢性、远期和累积性的。其危害主要表现在干扰体内自然激素的平衡、使正常人的生理功能发生紊乱，严重时还会致新生儿畸形，影响儿童的正常生长发育。

欧盟95/22/EC规定禁止使用雄性激素兽药，美国也规定其同类的丙酸睾酮在肌肉中的最高残留限量(MRL)为0.64μg/kg，我国2001年由农业部实施的行业标准《无公害食品水产品中渔药残留限量》(NY5070-2001)中，将甲基睾酮列为禁用药物。2002年发布的农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定甲基睾酮为禁止使用兽药，在所有食用动物的所有可食组织中不得检出。

目前国内外水产品中激素残留分析方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱测定法(LC-MS)等，其特点在于准确性高、灵敏度高、重复性好，然而，这些方法需要较长的实验时间及相应昂贵的实验设备，难以满足现代检测快速、简捷、现场化的要求，不适于大规模样本筛查。

胶体金免疫层析法是在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，该方法将反应所需要的原料的全部或大部分均已整合到试剂中，反应通常只需数分钟至数十分钟，检测结果以肉眼可见的显色条带来判读。此法具有简便快速、操作简单、特异性强、不需要额外设备等优点。

发明内容

本发明的目的是克服现有检测技术存在的缺陷，研制开发一种检测限符合要求，重现性好，适用于现场快速筛检水产品中甲基睾丸酮残留的免疫胶体金快速检测试剂板。

本发明的另一目的是提供该试剂板的制备方法。

本发明的再一目的是提供该试剂板的应用。

所述试剂板应用层析式抗体免疫竞争原理，通过抗原和金标抗体反应显色，特异性检测水产品中的甲基睾丸酮残留。如果样品溶液含有残留，甲基睾丸酮先和胶体金颗粒上的抗体反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的甲基睾丸酮占据而无法与检测线上甲基睾丸酮特异性抗原结合；当样品中的甲基睾丸酮含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色较质控线浅甚至无显色，判定为阳性。相反，当样品中甲基睾丸酮含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色与质控线相近或偏深，判定为阴性。

所述试剂板由上下两块塑料模板、背衬和背衬上依次紧密粘贴的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成。在样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻的地方有2mm±0.5mm的重叠，一方面是为了保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行，另一方面是为了使样品溶液与样品垫有充分反应时间，样品垫上的缓冲体系可以中和样品溶液的酸碱度，保证样品溶液中的有效成分与胶体金结合垫上的金标抗体顺利发生反应。

所述试剂板的各部分组成成分与功能如下：

塑料模板，起固定试纸条及标示功能区(加样孔、检测区、质控区)的作用。

背衬为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。

样品垫由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液与缓冲样品溶液pH值的作用。

胶体金结合垫由聚酯膜制成，其上包被有胶体金标记的抗甲基睾丸酮单克隆抗体，是样品溶液中的有效成分与金标抗体发生反应的场所。

硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向依次包被有甲基睾丸酮-牛血清白蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线，主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。

吸水垫为滤纸，作为吸水部分其作用是将移动上来的多余的溶液吸收。

所述试剂板的制备方法，包括如下步骤：

(1)甲基睾丸酮-载体蛋白偶联物的制备：将甲基睾丸酮MT与载体蛋白牛血清白蛋白BSA和卵清蛋白OVA分别进行偶联制备包被抗原MT-BSA和免疫抗原MT-OVA；

(2)抗甲基睾丸酮单克隆抗体的制备：按照常规方法使用免疫抗原MT-OVA免疫制得抗甲基睾丸酮单克隆抗体；

(3)使用柠檬酸三钠法制得平均大小为40nm的胶体金溶液；