[发明专利]花*精子超低温冷冻保存和复苏方法

权利要求书

1.一种花精子超低温冷冻保存和复苏方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）亲本选择：选择形态正常、生长良好、健康无疾病、达到性成熟的花雄鱼作为亲本，

（2）取精：对性成熟的雄鱼注射催产剂，在水温16-18℃环境中暂养16-20h后，轻压鱼腹，取精液；

（3）冷冻：将精液与稀释液按1:2-3的体积比混合均匀，2-4℃下平衡20-30min后，加入抗冻剂DMSO混匀得混合精液，分装至离心管中，置于液氮液面上方4-7cm处平衡15-20min，然后再置于液氮液面上平衡5-8min，再放入液氮中保存；

（4）复苏：从液氮中取出装有精液的离心管，置于液氮蒸汽中平衡5-10min，然后迅速置于37±1℃水浴中快速晃动至融化得解冻精液；

（5）人工授精：将解冻精液与花鱼卵混合进行人工授精。

2.根据权利要求1所述的花精子超低温冷冻保存和复苏及授精方法，其特征在于：所述催产剂由绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素A₂和马来酸地欧酮组成，每千克体重的鱼催产剂注射量为：绒毛膜促性腺激素500-750 IU，促黄体素释放激素A₂ 4-6微克，马来酸地欧酮2-3毫克。

3.根据权利要求1所述的花精子超低温冷冻保存和复苏及授精方法，其特征在于：所述稀释液的配方为：氯化纳1.0-1.5wt%、氯化钾0.05-0.1 wt %、葡萄糖1-2 wt %，余量为水。

4.根据权利要求1或2或3所述的花精子超低温冷冻保存和复苏方法，其特征在于：所述混合精液中抗冻剂DMSO占的体积百分比为6-8%。

5.根据权利要求1或2或3所述的花精子超低温冷冻保存和复苏方法，其特征在于：人工授精是将解冻精液与花鱼卵搅拌混匀后，加入泥浆水中，继续搅拌10-60秒，再用清水清洗鱼卵，洗净后放入孵化器中孵化。

6.根据权利要求5所述的花精子超低温冷冻保存和复苏方法，其特征在于：解冻精液与花鱼卵用量为每300ml鱼卵加10-15ml解冻精液。

7.根据权利要求5所述的花精子超低温冷冻保存和复苏方法，其特征在于：泥浆水的体积为花鱼卵体积的3-5倍。