[发明专利]一种测定外生菌根真菌影响土壤胶体表面特征与组成的方法

说明书

所属技术领域：

本发明涉及一种测定外生菌根真菌影响土壤胶体表面特征与组成的方法，能够为探究真菌影响土壤的深层机制提供技术支持。 

背景技术：

土壤环境的破坏主要是土壤流失、土壤质地恶化，这直接影响了作物产量、植物生产力，如何进行土壤修复是目前研究的一个热点。常用的土壤环境生物修复方法包括接种外生菌根真菌(Ectomycorrhizal fungi，ECM)，其能与植物根系建立互惠共生体来促进植物生长，与此同时，分泌胞外酶分解土壤中难分解的高分子化合物（动植物残骸的细胞壁磷脂、纤维素等），提高了土壤活性，增加土壤有机质的含量，改善土壤理化性质，增强土壤肥力等。 

野外土壤成分比较复杂且影响因子较多，对其进行实际观察和试验很难判断外生菌根真菌对土壤表面结构特征、土壤矿物结晶以及胶体表面附着有机物组成的影响。而土壤胶体是土壤中最细微、最活跃的部分，与其它粒径组分相比具有大的多的比表面积和丰富的表面电荷，很大程度上决定了土壤的理化性质。因此，研究土壤胶体特性和外部条件对其环境行为的影响，对全面掌握土壤变化趋势具有重要意义。 

激光粒度仪是根据光的散射原理来测定颗粒粒径大小的，通过其可以探究土壤颗粒粒径大小的变化。扫描电镜是利用电子束扫描样品表面获得样品信息，原子力显微镜和扫描电镜都是用来观测样品表面特征的设备，原子力显微镜通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质，二者的结合能够更直观的感应土壤胶体表面结构的变化。根据X射线衍射图谱可以分析土壤的矿物成分，计算结晶度、晶粒尺寸等相关指标。红外光谱能够提供粘土矿物及胶体吸附前后官能团的变化情况。X射线光电子能谱是通过光子入射到固体表面激发出光电子，利用能量分析器对光电子进行分析的实验技术，可以对土壤胶体的元素成分进行定性、定量或半定量及价态分析。这些技术方法为更加全面的探究真菌菌液对土壤的影响提供了技术支持。 

发明内容：

本专利的目的在于通过制备真菌菌液和提取土壤胶体，让二者混合，利用激光粒度仪、原子力显微镜、扫描电镜、X射线衍射、红外光谱、X射线光电子能谱进行分析，探究真菌对土壤胶体表面结构特征、矿物组成和有机组成的影响，旨为揭示真菌影响土壤的深层机理提供技术支持。 

为了达到上述目的，本专利采用的技术方案包括： 

1.真菌菌液的制备：将野外采集外生菌根真菌，用MMN固体培养进行纯化培养，直至无杂菌产生为止。然后在无菌条件下接种到液体MMN培养基（去掉琼脂）里培养15～20d。最后进行真菌菌液的制备：首先用4层纱布将培养液过滤掉，然后用超纯水反复冲洗菌丝体，将冲洗干净的菌丝体移至研钵中，充分研磨，再移至离心管内12000rpm离心10min（4℃），提取的上层悬浮液即为真菌菌液。 

2.土壤胶体的制备：将野外采集的土壤去除植物根系、砖头石块等杂质，混合均匀、磨碎，0.25mm过筛。称取一定量的土壤，使土壤：超纯水的比例为1：100，充分混匀后，自然沉降24h，将上层悬浮液取出，12000rpm离心10min（25℃），弃去上清液，底层即为土壤胶体原液。然后将胶体原液进行稀释，得到实验所用的土壤胶体溶液。 

3.土壤胶体与真菌菌液的反应及测定方法：取4ml土壤胶体溶液加入10μl真菌菌液，对照组用10μl超纯水代替真菌菌液。将二者混合后的溶液12000rpm离心10min（4℃），弃去上清液，除了红外光谱直接将底层土壤胶体真空干燥48h外，其余技术方法都是加4ml超纯水将土壤胶体溶解，制备不同的样品， 利用激光粒度仪、原子力显微镜、扫描电镜、X射线衍射、红外光谱、X射线光电子能谱进行分析。 

4.分析方法：激光粒度仪观察土壤胶体经真菌菌液处理前后的颗粒粒径大小及分布的变化，原子力显微镜和扫描电镜观察土壤胶体表面结构特征的变化，利用X射线衍射图谱的峰位辨认土壤的矿物组成，并比较各矿物质经真菌菌液处理前后的晶粒尺寸和相对结晶度的变化，红外光谱和X射线光电子可以探究土壤官能团及有机元素组成的变化。 

本发明的技术特征： 

1.本发明采用的室内控制实验，避免了野外试验客观影响因子的干扰。 

2.通过液体培养外生菌根真菌，繁殖快，培养周期短。 

3.本发明选用土壤胶体，不但能很好的反映土壤的理化性质，并且也缩短了实验周期，制备方法简易。 

4.每一种测定方法都用超纯水作对照，避免了其他客观因素的干扰。