[发明专利]铜银离子荧光蛋白探针及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及Cu/Ag离子的检测探针，具体涉及Cu/Ag离子的重组荧光融合蛋白检测探针。本发明也涉及上述检测探针的制备方法及其在检测Cu/Ag离子中的应用。

背景技术

金属离子检测的传统方法主要有原子吸收光谱，原子发射光谱，分光光度法，电耦合等离子体质谱法，电化学法和荧光分析法等，这些方法各有其优缺点，或对仪器设备和操作有一定要求而容易受限，或对过度金属半径的区分度不高在检测中易受干扰。荧光分析法因其具有高灵敏性和易操作等优点而为研究者所青睐，建立在其基础上的荧光小分子化学探针有了长足发展。以芳烃类和多胺类为代表的小分子化学探针难免具有灵敏度参差不齐，作用介质单一的缺点。而且外源合成的化学小分子探针要表征细胞内的金属离子活动，在进入细胞膜以及发挥作用的过程中有很多因素使得这一过程不能顺利进行，如小分子探针的透膜性，可能存在的细胞毒性等等，因而不能满足生命医学科学研究的要求。因此，本领域急需发展一种针对铜银离子的特异性检测技术，特别是一种适合生理水平和亚细胞水平的特异性铜银离子检测技术。

伴随着分子生物学和蛋白质科学的快速发展，细胞内金属转录调控蛋白家族的结构和性质研究日益清晰，这些转录调控蛋白往往对金属离子有特异性的结合能力，它们对金属离子的亲和性可用来推断细胞内游离金属离子的含量。这些蛋白成为了利用荧光蛋白策略构建细胞内金属离子探针的天然模式蛋白。

而相对于传统的小分子染料检测技术以及迅速发展的量子点检测技术，荧光蛋白检测技术在大多数的活体细胞成像方面具有独一无二的压倒性优势，它能够通过遗传导入至细胞、组织乃至整个器官中，因此荧光蛋白能够作为一个全细胞标记物或基因启动激活的指示器。

绿色荧光蛋白最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)中提取，野生型的AvGFP由238个氨基酸构成，分子量约为26kD。当前的研究确认，天然GFP蛋白中第65～67位的三个氨基酸Ser-Tyr-Gly能够自发形成一个荧光生色基团：对-羟基苯亚甲基咪唑啉酮(ρ-hydroxybenzylideneimidazolinone)，是其主要的发光位置。野生型AvGFP的光谱特征十分复杂，其荧光激发的主峰在395nm处，而在475nm处另有一个附峰，后者振幅强度约为前者的1/3。在标准的溶液条件下，395nm处的激发可产生508nm处的发射，而475nm处的激发产生的最大发射波长位于503nm(Heim，R.等，Proc Natl Acad Sci U S A.1994，V.91(26)，pp.12501-12504)。

随着对GFP蛋白突变的研究日渐深入，利用分子生物学技术，目前已经发展出多种表现突出的GFP衍生物，通过在野生型GFP基础上进行不同的单点突变或者组合，可获得诸如增强型GFP(S65T，F64L)、YFP(T203Y)、CFP(Y66W)等。而借助对GFP蛋白序列的重新排列，将原第145-238位氨基酸部分作为新蛋白的N端，原第1-144位氨基酸作为新蛋白的C端，两片段间通过一小段具有柔性的短肽链连接，形成一个对空间变化敏感的环状排列荧光蛋白(circular permutation fluorescent protein)，在此基础上对原蛋白T203Y进行的点突变就形成了环状排列的黄色荧光蛋白cpYFP(Nagai，T.等，Proc Natl Acad Sci U S A.2001，V.98(6)，pp.3197-3202)。