[发明专利]籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法

说明书

技术领域

本发明属于植物的组织培养领域，具体涉及籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法。

背景技术

为了进一步提升水稻产量和提高水稻应对极端天气状况的能力，人们不得不把希望寄托于基因工程技术。现在水稻转基因研究领域应用的最为广泛的转基因方法是农杆菌介导的水稻遗传转化法，而这种转化方法都是以愈伤组织作为农杆菌侵染的受体材料，所以高效率诱导出高质量的愈伤组织对于整个水稻转基因研究领域有着重要意义。

目前，粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基已经有了比较成熟的培养基配方和愈伤组织诱导方案。但是在籼稻愈伤组织培养方面一直没有找到合适的通用诱导培养方案，各种诱导培养基之间通用性较差，诱导效果不够理想，主要表现在诱导率低、生根率太高以及愈伤组织褐化严重等问题。所以现在人们往往是针对每一种籼稻品种摸索一种特定的针对其的最适诱导培养基。

发明内容

针对籼稻超级稻母本核雄性不育系双8S采用已有诱导方法组培时存在的诱导率低、生根率太高以及愈伤组织褐化严重等问题，本发明的目的在于提供一种籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法。

本发明提供的一种籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法，包括如下步骤：

1）第一次诱导培养：获得经灭菌消毒的双8S带胚米粒，接种到N6大量50ml/L+MS微量10ml/L+MSV铁盐10ml/L+VB110mg/L+VB₃10mg/L+VB₆10mg/L+2,4-D2.5mg/L+6-BA0.2mg/L+水解酪蛋白400mg/L+脯氨酸500mg/L+肌醇100mg/L+植物凝胶3.2g/L+蔗糖30g/L的诱导培养基上，放入暗室培养10-12天，获得愈伤组织；

2）愈伤组织继代培养：将步骤1）获得的愈伤组织切下，转入新的诱导培养基，放入暗室培养10-12天，获得双8S成熟胚愈伤组织。

其中，步骤1）所述灭菌消毒为将带胚的米粒放入体积百分比75%的乙醇溶液浸泡90s，无菌水洗2次，次氯酸钠溶液浸泡30min，无菌水洗5-8次后干燥。

其中，步骤1）所述第一次诱导培养，用9cm口径培养皿进行，接种量为32-35粒双8S带胚米粒每个培养皿。

其中，步骤2）所述愈伤组织继代培养，用9cm口径培养皿进行，接种量为22-25粒愈伤组织每个培养皿。

其中，所述诱导培养基的pH值为5.83。

其中，所述暗室培养的培养温度为28℃。

本发明还提供所述的一种籼稻光温敏核不育系双8S成熟胚愈伤组织诱导方法在双8S繁育中的应用。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明的方法可以大幅度提高籼稻超级稻母本双8S成熟胚愈伤组织诱导率，统计结果显示诱导率大于90%。

（2）在以往的愈伤组织诱导试验过程中，愈伤组织褐化严重和大面积生根现象一直是影响愈伤组织诱导率和愈伤组织品质的两个重要因素。而采用本发明的方法后，降低了愈伤组织诱导过程中的长根率（长根率=0），同时褐化现象显著降低，得到了质地均匀色泽淡黄的愈伤组织，改善了愈伤组织品质。

（3）在诱导培养12d后切下愈伤组织接入新的培养基进行继代培养，这样的培养方式既不影响愈伤组织品质又可以增加愈伤组织质量300%以上。

（4）诱导出的大块体积愈伤组织可以切碎成小块，进行农杆菌转化试验，在愈伤组织诱导过程中更换了一次培养基，把整个愈伤组织诱导时间缩约为20至24d。

附图说明

图1：实施例2第一次诱导培养12d后双8S愈伤组织照片。

图2：实施例2第一次诱导培养12d后切下的双8S愈伤组织照片。

图3：实施例2继代培养12d后的双8S愈伤组织照片。

图4：实施例3第一次诱导培养12d后两种培养基上的愈伤组织照片。

图5：实施例3继代培养12d后两种培养基上的愈伤组织照片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1诱导培养基配法