[发明专利]一种TRPC6蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学技术及其相关应用领域，具体涉及一种TRPC6蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法和试剂盒。

背景技术

瞬时受体电位阳离子通道6（Transient Receptor Potential Channel，TRPC6）在钙信号通路传导中发挥着非常重要的作用，TRPC6基因编码的TRPC6蛋白可通过形成同型或异型聚合体，组成非选择性离子通道，钙离子和钠离子就会经此通道进入细胞内。钙离子通道是机体各项生理活动不可缺少的离子通路，能够维持细胞膜两侧的生物电位、维持正常的神经传导功能、肌肉伸缩与舒张功能、神经－肌肉传导功能，还有一些激素作用等机制均通过钙离子通道分子表现出来，TRPC6在心脏、肾脏、肌肉等人体重要器官中组织中均有相应的表达，而TRPC6作为钙离子重要的非选择性离子通道，其通过调节胞内钙离子浓度介导的钙信号通路再调节人体的各种重要生理效应，近年研究表明，TRPC6分子可作为某些药物作用的靶向分子，其蛋白表达水平的变化与人类的各种疾病密切相关。

目前用于检测TRPC6蛋白表达的多为多克隆抗体，在应用中非特异性结合因素多，难于评价和分析结果，制备TRPC6单克隆抗体有其优势，并克服了多克隆抗体的局限性。此外，有关各组织细胞TRPC6表达的研究，多以检测TRPC6 mRNA为主，目前尚未见到在蛋白水平上分析结果，利用TRPC6单克隆抗体构建体外免疫学技术方法，以此测定蛋白水平的表达，更有利于疾病监测的辅助诊断。

酶免疫分析技术是将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术，其发展由早期的竞争法、间接法到现在的双抗原夹心法、双抗体夹心法和酶放大免疫分析方法等。随着酶标记技术进展，标记酶的应用已从过氧化物酶，扩展到碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、尿素酶等，但应用最多的仍然是辣根过氧化物酶（HRP）。本实验在所建立的稳定分泌抗TRPC6单克隆抗体杂交瘤细胞的基础上，经过免疫球蛋白Ig亚类鉴定为IgG类，抗体生物学特性测定筛选出mAb-H8在特异性上和亲和力较强，再利用所制备的抗TRPC6多克隆抗体pAb-T，构建双抗体夹心ELISA法，最终在抗IgG-HRP放大作用下，以用于TRPC6蛋白表达的测定，该方法的建立对于各种组织细胞的TRPC6表达研究具有实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于为了克服现有技术中TRPC6蛋白检测技术的不足，提供一种TRPC6蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法。该方法可用于测定各种组织细胞TRPC6蛋白表达水平。

本发明的另一个目的是提供一种TRPC6蛋白的双抗体夹心ELISA检测试剂盒。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

    一种TRPC6蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法，包括如下步骤：用TRPC6蛋白单克隆抗体mAb-H8包被微孔板，封闭液封闭微孔板后，分别加入标准TRPC6多肽和待测样品的稀释液，再加入TRPC6蛋白多克隆抗体pAb-T，然后加酶标二抗，洗涤后加底物显色，用酶标仪在490nm波长下测定OD 值，制得标准TRPC6多肽的标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中TRPC6蛋白浓度；

所述TRPC6蛋白单克隆抗体mAb-H8是由杂交瘤细胞株H8分泌后纯化得到；杂交瘤细胞株H8是由TRPC6多肽作为抗原制备得到，能够分泌抗TRPC6的单克隆抗体，于2012年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC-C201236。TRPC6多肽的氨基酸序列为：KDLTKVTLGDNVKYY（如SEQ ID NO：1所示）。杂交瘤细胞株H8的制备方法记载在申请号：CN201210145560.7；发明名称为：TRPC6抗原多肽和抗TRPC6的单克隆抗体的专利中。

优选地，所述TRPC6蛋白单克隆抗体mAb-H8在包被微孔板时的工作浓度为5~20μg/mL；更优选地，所述TRPC6蛋白单克隆抗体mAb-H8在包被微孔板时的工作浓度为10μg/mL。

所述TRPC6蛋白多克隆抗体pAb-T是由TRPC6多肽-KLH偶联物免疫大鼠后分离血清纯化得到的；所述TRPC6多肽的序列为：KDLTKVTLGDNVKYY，如SEQ ID NO：1所示。所述TRPC6多肽-KLH偶联物的制备方法可参照本领域常规试验方法。选择的酶标二抗是本领域常规使用的，所述的标记酶为辣根过氧化物酶。