[发明专利]动物布鲁氏菌病竞争ELISA 抗体检测试剂盒

说明书

技术领域本发明涉及一种动物布鲁氏菌病诊断方法——动物布鲁氏菌病竞争ELISA抗体检测试剂盒，属生物制品检测技术领域。 

技术背景

布鲁氏菌病（布病）是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌（Brucella）引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。 

布病在世界存在已有久远的历史，人类对该病的研究认识逐步加深，诊断水平不断提高，随着动物布病的研究进展，动物布病血清学的检测方法不断改进和提高。传统的凝集试验（如：虎红抗原平板凝集试验、试管抗原凝集试验、乳环凝集试验）逐渐被敏感性高、特异性强的ELISA方法、荧光偏振试验（FPA）等新的检测技术所取代。 

凝集试验是布鲁氏菌病诊断的一种常用的方法，包括血清凝集实验、乳环沉淀试验和抗人免疫球蛋白试验，其中经典的标准试管凝集试验(STAT)、平板凝集试验(PAT)，以上方法在发达国家已经基本停止使用，取而代之的是缓冲布鲁氏菌抗原凝集试验如虎红平板凝集试验(RBPT)。虎红平板凝集抗原是用抗原性良好的布鲁氏菌菌株经培养，灭活，离心收集菌体后用虎红染料染色后悬浮于乳酸缓冲液中制成，该方法灵敏度高，价格便宜，操作方便，检测快速，适于动物群体布鲁氏菌病的普查。在国际贸易中是牛、羊、猪布鲁氏菌病检测的指定试验，在我国也用于人布鲁氏菌病监测的初筛。乳环沉淀试验依然是乳牛布鲁氏菌监测的主要方法，该方法直接对牛乳进行检测，可以对奶牛群体进行筛检，该方法简便快速。凝集试验主要检测抗布鲁氏菌LPS-O链的抗体，而布鲁氏菌的LPS-O链是多种革兰氏阴性菌的共同抗原，因此布鲁氏菌与其他革兰氏阴性菌存在的交叉感染用试管凝集试验无法鉴别，这也是布鲁氏菌病诊断存在的一大难题。 

在布鲁氏菌病血清学检验中一致认为补体结合试验（CFT）在特异性上优于其他方法，常被用来对试管凝集试验和虎红平板凝集试验检测为阳性或可疑的病例进行定性检测。补体结合试验一直被认为是最有效的布病诊断方法，至今尚没有一种诊断方法能取代补体结合试 验在血清学诊断中的地位。但补体结合试验所需要的溶血素的制备困难，试验操作繁琐，难以在临床上普遍使用，而且由于猪体内的补体会干扰豚鼠补体的作用，导致敏感性下降。 

ELISA是一种与CFT效果相当的诊断方法，该方法操作方便，灵敏度高，特异性较好，一次可以完成大量样品的检测，既可以作为筛选试验应用于动物群体检疫，还可以作为确诊试验。ELISA不仅可以应用于血清抗体的检测，还可应用于乳样中抗体的检测。牛的布鲁氏菌病ELISA检测方法已是国际贸易中指定的检测方法之一，其他种布鲁氏菌的ELISA检测方法也是研究的热点。目前，用于布鲁氏菌病检测的ELISA有间接ELISA（iELISA）和竞争ELISA（cELISA）两种。 

由于cELISA使用的是针对布鲁氏菌LPS的特异性单克隆抗体与待检动物血清中针对布病的抗体进行竞争，使用的二抗是针对小鼠IgG的酶标抗体，所以相对于iELISA而言，cELISA可以同时检测猪、牛和羊的血清，而目iELISA只能是针对其中某一种分别建立诊断试剂盒。因此，cELISA试剂盒具有更广泛的宿主适应性。但目前商业化的cELISA试剂盒存在的主要技术缺陷在于不能有效排除耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157感染动物的血清干扰，从而使其特异性受到一定程度影响。 

由耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157（特别是O157：H7型）细菌中脂多糖（LPS）与布鲁氏菌LPS具有极高的同源性，干扰了布鲁氏菌病的诊断。到目前为止，无论是传统的凝集试验，还是现在被广泛使用的ELISA试剂盒，都不能有效区分以上2种细菌感染动物的血清，因而给布病的诊断带来了潜在的非特异性。有研究拟使用布鲁氏菌的外膜蛋白OMP28、OMP31等蛋白建立布鲁氏菌的诊断试剂盒，但均因以上蛋白特异性抗体的产生与感染细菌的种属及被感染动物的品种存在严格的依赖性，导致其使用范围严重受限，从而失去了其进一步被开发成试剂盒的可能。 

本发明的目的在于另外，国外同类技术抗原多采用牛种布鲁氏菌A99株，主要用于检测牛布鲁氏菌病。 

发明内容

本发明的目的在于制备一种能有效排除小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157对布鲁氏菌病检测的干扰和对猪、牛、羊的布鲁氏菌病均能检测的检测试剂盒。