[发明专利]一种羊胚胎活性肽的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物活性物质的提取方法，具体涉及胚胎活性肽的提取方法。

背景技术

羊胚胎小分子生物活性肽，又名羊胎素，是胚胎细胞分化发育的调控原件，能使受精卵准确无误地分化为各种组织细胞，能促进细胞分化与细胞增殖。小分子活性肽具有高度的保守性，其同源性很高，没有免疫原性，不会出现过敏反应，对人体没有副作用，可以为人类所利用小分子生物活性肽能直接进入细胞内修复受损细胞的DNA，保护与修复受损细胞，恢复受损细胞的结构与功能。因此，羊胚胎小分子生物活性肽能用于激活人体细胞活力、使老化细胞恢复细胞的结构与功能，保持细胞的活力状态；并用于激活免疫细胞，能增强人体免疫细胞活力，使人体抗病能力增强。

目前，生物领域对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：酸碱制备法、盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化，同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段，如层析、电泳等。

酸碱法制备生物活性肽工艺简单，但是具有氨基酸受损严重，水解程度难以控制，副产物较多，影响肽的结构及功能，同时可能有酸、碱或其它物质残留等缺点，故而限制了该方法的广泛应用。酶解法使多肽和氨基酸损失较多，降低了活性肽的活性；且工序较为烦琐，成本较高。其它方法提取小分子多肽主要是不能全部回收所需要活性肽，也很难达到规模化生产的目的。

发明内容

针对目前羊胚胎生物活性肽提取技术中存在的各种不足，本发明的目地在于提供一种新的羊胚胎活性肽提取方法，该方法最大限度收集了多种生物活性肽成分，并最大限度的保持了羊胚胎生物活性肽的活性，且工艺又简单环保。

为实现上述发明目的，本发明羊胚胎活性肽提取方法的详细技术方案依次包括下列步骤：（1）．取6～16周羊胚胎新鲜组织，切碎后加入生理盐水，经组织匀浆机匀浆；匀浆后快速冻融，即放入-20℃冰箱快速冷冻，30分钟后取出，放入40℃水浴箱中快速融解；（2）．超声裂解，每间隔30秒启动超声探头，超声持续时间15秒，重复3～5次；（3）．4℃低温高速离心30分钟，取上清液；（4）．将上清液用5k超滤膜离心超滤，澄清，得超滤液，即为羊胚胎活性肽溶液。

在步骤（1）中，匀浆后快速冻融可重复1～2次。

在步骤（2）超声裂解时，超声频段最好设定为3000Hz。

在步骤（4）对上清液离心超滤时，最好控制流速为10～20ml/min。

上述制得的羊胚胎活性肽溶液还可以经进一步低温冷冻干燥，获得羊胚胎活性肽冻干粉。还可以根据需要，以羊胚胎活性肽溶液或冻干粉作为有效成分，用常规药剂制备方法，加入常规的药学载体各药学辅料，如填充剂、粘合剂、崩解剂等，可以制备出各种药学可接受形式的各种口服制剂，如颗粒剂、片剂和胶囊剂等。

 在本发明的工艺中，羊胚胎组织匀浆后在-20℃与40℃之间快速冻融及超声裂解，能使细胞内天然小分子活性肽全部释放出来；低温高速离心能去除组织匀浆液中未能被超声裂解所破碎的的杂质碎片；上清液经超滤后截留大分子蛋白质，millipore离心超滤澄清，截留分子量大于5kD的多肽或蛋白质，从而使滤液中活性肽分子量控制在5000D以下。

用本发明的方法提取的羊胚胎活性肽，经生物信息学分析，对胚胎活性肽的氨基酸序列、一级结构与功能进行比对分析，符合生物信息学中有关生物活性肽的特征。利用HPLC分析方法对提取物进行分析，得到多肽的质谱图，测出该蛋白峰的分子量为3520道尔顿分子量分别为2039，2481，2929，3369，4300，4959道尔顿多个多肽分峰。

与现有技术相比，本发明的具有如下明显的优点和效果：1.本发明的提取方法无需任何酸碱处理，从而有效的避免了化学方法处理带来环境污染，也避免了对产品的污染。2.本方法最大限度收集了多种生物活性肽成分，活性肽的分子量有效的控制在5000D以下，最大限度地保持了羊胚胎小分子肽的生物活性。

说明书附图

图1是本发明实施例1制备的羊胚胎活性肽HPLC分析质谱图；

图2是HPLC分析24分钟处洗脱的多肽的质谱图；

图3是HPLC分析27分钟处洗脱的多肽成分的质谱图；

图4是小牛thymosin α1标准经HPLC分析洗脱的多肽的质谱图。 

具体实施方式