[发明专利]快速获取鹅α烯醇化酶基因编码区序列及定量检测其表达的方法及其引物

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种快速获取鹅α烯醇化酶基因编码区序列及定量检测其表达的方法及其引物。

背景技术

α-烯醇化酶(α-enolase，ENO1)是一种在细胞质和细胞核中表达的糖酵解关键酶，主要催化2-磷酸甘油酸水解成磷酸烯醇式丙酮酸的反应。研究表明小鼠成熟卵泡中卵母细胞的ENO1表达量显著高于壁层颗粒细胞，若将成熟卵母细胞与壁层颗粒细胞共培养能显著提高壁层颗粒细胞ENO1表达水平。但卵母细胞自身缺乏代谢葡萄糖的能力，通过这种细胞间“对话”，可以协调颗粒细胞代谢葡萄糖的效率，为卵母细胞提供营养支持。由此可见ENO1在成熟卵泡内不同细胞间的信息交换对卵泡发育具有重要作用。蛋白质组学研究发现，胰腺癌细胞中的ENO1表达量均显著高于正常细胞，表明ENO1可作为早期诊断胰腺癌的生物标记物。ENO1作为糖酵解关键酶，高水平表达可以加速糖酵解过程，确保癌细胞合成大分子物质，能够促进癌细胞的增殖、抑制其凋亡，利于发挥局部微环境中自分泌和旁分泌功能。此外，研究资料表明，ENO1可作为纤维蛋白溶酶原受体参与纤溶过程，从而调节细胞的融合和分化进程；作为c-myc启动子结合蛋白，能与c-myc P2启动子结合，负向调控细胞生长、分化；同时还发现自身免疫病性视网膜病变患者体内存在抗ENO1抗体，并特异定位于神经节细胞层及内核层，诱导该区域细胞发生凋亡，导致失明。然而，ENO1在家禽中的相关研究较少，尤其是鹅ENO1基因的结构和功能目前仍不清楚。本专利采用常规RT-PCR和基因克隆等技术成功建立了获取鹅ENO1完整编码区序列的方法，同时还建立了一整套研究鹅ENO1表达规律的实验技术流程，为研究并阐明ENO1的功能奠定理论基础，揭示家禽糖酵解过程以及细胞增殖和凋亡的机制提供新途径。

分段克隆：将目的基因分成几段来克隆，然后将所有分段的片段进行拼接，最终获得完整的目的片段。在进行分段克隆时需要设计多对引物，且每对引物必须有重叠，在将所有片段克隆出来后还需进行一次PCR反应检测所获取的片段是否为目的片段。

快速扩增cDNA末端技术(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)：RACE技术是基于PCR技术基础之上，分别在cDNA序列的3’末端和5’末端设计特定引物，然后进行克隆，从而获得cDNA全长序列的方法。

半定量反转录-聚合酶链式反应(Semi-Quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction，SQRT-PCR)：SQRT-PCR技术是指将mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，取等量的PCR产物，在同一块琼脂糖凝胶上进行电泳检测，然后通过比较电泳图中目的基因和内参基因条带的光密度值计算目的基因表达量(或拷贝数)的定量检测技术。

分段克隆和RACE技术都需要做许多次的PCR和克隆工作，操作过程繁琐，工作量大，耗时长，且成本高。

SQRT-PCR技术采用的PCR反应终点法。因此，现有方法只能在PCR反应结束时，获得目的基因片段拷贝数，不能全程了解定量过程中的变化。由于受到半定量电泳操作的影响、凝胶成像系统和光密度分析的分辨率和准确性的限制，定量结果会出现较大偏差和误差，不能十分准确的检测目的基因表达量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种快速获取鹅α烯醇化酶基因编码区序列及定量检测其表达的方法及其引物。

本发明的技术方案如下：

一种快速获取鹅α烯醇化酶基因编码区序列的方法，根据GenBank上原鸡和火鸡ENO1基因的编码序列设计并合成特异性引物ENO1-L，其序如为SEQ ID NO：1-2所示；PCR反应参数设置：95℃5min；95℃30s，62℃30s，72℃60s，30cycles；72℃10min。

一种定量检测权利要求1所述鹅α烯醇化酶基因表达的方法，根据GenBank上原鸡和火鸡ENO1基因的编码序列设计并合成特异性引物ENO1-S，其序列如SEQ ID NO：3-4；PCR反应参数设置：95℃5min；95℃10s，57℃30s，72℃30s，35cycles；72℃10min。