[发明专利]一种生物功能化金纳米荧光探针及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物功能化金纳米荧光探针，其制备方法及所属纳米材料用于肿瘤等疾病生物标识物检测应用，属于生物医学工程以及纳米医学领域。 

背景技术

在疾病体外诊断方面，高特异性、高灵敏度和高通量特性的检测技术不仅能有效简化病变样品制备的流程，避免有毒害试剂的使用和反应抑制剂的干扰，同时快速检测方法的建立，简化操作流程，节约检测成本，提高了检测的时效性和准确性。目前临床生物标志物检测的金标准是酶联免疫吸附法。由于其中等程度的敏感性，只有生物标志物的水平已经达到临界阈值浓度后才能检测，限制了其用于疾病早期检测应用，因此临床上对超高灵敏检测的需求尤为紧迫。正像20世纪70年代的微米技术一样，纳米技术将成为21世纪的主导技术，为生物诊疗领域的发展提供了很大空间。目前光、磁和电响应纳米粒子已经广泛应用于纳米医学、分子影像学等领域。 

金纳米颗粒具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。因此，以金纳米颗粒为免疫标记物的检测技术得到了很大的推广应用。如将蛋白质等高分子吸附到纳米金颗粒表面的包被过程而形成的纳米金标记技术在基础研究和实验中成为非常有用的工具。通常情况下，纳米金颗粒与蛋白质因静电吸附而形成牢固结合，而且吸附后不会使生物分子变性，由于金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，但在定量检测及灵敏度方面尚待提高改进。 

开发出具有低背景值，高靶向性和高敏感性的纳米生物检测探针成为了当前纳米医学领域研究热点。可激活分子探针基本结构是由以下几部分构成的：某种蛋白酶的底物，一个荧光报告基团和一个相应的荧光淬灭基团。与传统分子探针相比较，可激活分子探针在初始状态下处于“淬灭”状态，而只有在与靶点分子结合后才会被“激活”而释放出强烈 信号，从而为成像仪器所检测到。因此，智能分子探针具有低背景，高对比度和高敏感性等成像优势。 

本项目将荧光染料高效富聚于金纳米粒子表面并处于淬灭状态，进一步修饰检测抗体或核酸适配体。金纳米荧光探针能与疾病生物标识物高效结合，荧光染料仍处于淬灭状态，当向检测系统加入含巯基化合物如半胱胺后，金纳米粒子表面高效富聚的荧光染料发生脱离并导致荧光探针的显著激活，荧光强度与样品中的生物标识物的浓度成比例，从而达到高灵敏度检测疾病生物标识物的目的。 

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种生物功能化的金纳米荧光探针； 

本发明的另一目的在于提供一种新的生物功能化金纳米荧光探针的制备方法； 

本发明的再一目的是提供一种所述的金纳米荧光探针作为肿瘤等疾病生物标识物检测系统的应用。 

本发明的目的可以通过如下技术方案实现： 

一种新的生物功能化的金纳米荧光探针，其特征为含有检测抗体或核酸适配体，荧光染料表面修饰的金纳米粒子。 

其中，所述的金纳米颗粒包括纳米金粒子、纳米金棒、纳米金星、纳米金囊，纳米金笼或纳米金壳中的至少一种。 

其中，所述的荧光染料包括：荧光素类染料：包括标准荧光素及其衍生物，如异硫氰酸荧光素（FITC）、羟基荧光素（FAM）、四氯荧光素（TET）等。罗丹明类染料：主要包括R101、四乙基罗丹明（RB200）和羧基四甲基罗丹明（TAMRA）等。菁染料：一类是噻唑橙（thiazole orange,TO）、噁唑橙（oxazole orange,YO）系列及其二聚体染料，另一类是多甲川系列菁染料。以及其他荧光染料，例如二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芘类等。罗丹明B异硫氰酸酯等。本发明优选采用罗丹明B异硫氰酸酯。 

其中，所述的抗体或核酸适配体，为一种或多种检测抗体或核酸适配体，其根据检测靶标物质而定。 

其中，所述探针采用荧光激活剂激活，所述的荧光激活剂包括一种或多种含巯基化合 物。所述的含巯基化合物包括半胱胺（CS）、二硫基苏糖醇、硫基十一酸、聚乙二醇、谷胱甘肽等。优选采用半胱胺。 

生物功能化金纳米荧光探针制备方法，包括 

1）枸橼酸盐-金纳米粒子溶液中加入过量荧光染料中，反应0.5-3小时后，离心分离去除过量的荧光染料； 

2）将2抗或核酸适配体加入到表面富集荧光染料的金纳米粒子溶液中，在室温条件下轻微震摇1-3小时；将2抗-荧光染料-金纳米粒子复合物溶液进行两次离心分离以除去过量的2抗；