[发明专利]一种颅神经嵴源性干细胞的培养方法和鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于干细胞生物技术领域，涉及颅神经嵴源性干细胞的培养、纯化与鉴定。

背景技术

神经嵴源性干细胞是胚胎发育过程中的一种重要细胞类型，起源于胚胎发育早期的颅神经嵴在胚胎早期神经管闭合之前，颅神经嵴干细胞发生广泛迁移，其定位于上、下颌突内的神经嵴源性干细胞又称为外胚间充质干细胞外胚间充质干细胞属于胚胎发育时期过渡细胞，在牙发育中进一步分化形成牙周膜干细胞、牙髓干细胞，这些干细胞一并也称为神经嵴源性干细胞。

神经嵴细胞的迁移可以根据嵴细胞的显著形态学特征进行观察;在明显表达表型之前，神经嵴细胞就广泛地迁移并精确定位于在胚胎各处，可分为颅神经嵴细胞和躯干神经嵴细胞。嵴细胞的多向分化潜能以及胚胎环境对嵴细胞迁移、定位和表型表达影响的研究证实，颅神经嵴细胞参与了颌面部各组织器官的发育。在神经褶形成时或神经管形成之后，颅神经嵴细胞向侧腹方迁移到第一和第二咽囊之间的细胞，形成舌弓;眼前方的颅神经嵴细胞参与颅骨的形成;上、下颌突组织内的颅神经嵴细胞参与了牙齿的发育。

近印来，颅神经嵴干细胞因其具有自我复制和多向分化潜能、参与多种组织修复再生等优点，并在颌面部组织器官发育中起着重要作用，而受到研究者的普遍关注。迄今为止，国内外研究者一直通过不同途径了解神经嵴源性干细胞的生物学特性。由于神经嵴组织量小，采用常规显微手术方式分离神经嵴组织获取该类细胞，还存在相当的技术操作难度和进一步纯化问题。目前，神经嵴源干细胞的特异性表面分子仍在探寻中，这也给神经嵴源性细胞的分离、纯化的实际应用带来了一定的困难。专利公开号为CN101717750A及CN101717751A采用间叶系干细胞特异性标志物stro-1和CD146作为牙周膜干细胞及牙髓干细胞的标记物仅能证实其间充质源性，对于神经嵴源性却无法证实。专利公开号为CN1590537采用特异性抗体HNK-1/CD57获得的细胞需要用牛垂体提取物及白细胞抑制因子维持外胚间充质干细胞的增殖及生物学稳定性，细胞获取操作复杂，在体外培养容易分化，且HNK-1/CD57主要集中表达于牙源性外胚间充质细胞，其它颌突组织并无特异性。

发明内容

本发明的目的是提供一种颅神经嵴源性干细胞的培养方法。

本发明的目的是通过以下措施实现的:

一种颅神经嵴源性干细胞的培养方法，其特征在于:采用sox-2基因从11～12天鼠胚颌突组织中分选所述颅神经嵴源性干细胞。优选为11.5天的鼠胚颌突组织。该时期颅神经嵴干细胞游走至颌突组织，形成特定的细胞凝聚区。该时间节点的细胞仍保持颅神经嵴源性多能干细胞特性，尚未受局部微环境诱导，参与颌面组织器官发育及成牙分化的基因尚未启动，有利于通过体外培养研究神经嵴细胞基本特。

在颅神经嵴发育期，sox-2沿神经外胚层表达，呈带状分布。在胚胎发生中，sox-2基因表现出多样、动态的表达模式，在各种发育事件中起着重要作用。sox-2在颅面部组织中提取的神经嵴源性干细胞均为强表达，而在躯干神经嵴中不表达或呈弱表达。sox-2主要表达于早期鼠胚的多能性干细胞，成熟细胞无表达，sox-2与终末分化细胞的标记基因以相互排斥的方式表达，有利于神经嵴源性干细胞的筛选与纯化。

上述采用sox-2基因分选是指采用带荧光sox-2+抗体标记细胞，在流式细胞仪上分选，获取sox-2+细胞。可以去除原代细胞中非神经嵴源性杂细胞，使细胞得到高度纯化。

上述原代细胞的培养基为DMEM/F12培养基，添加以下成分:10%胎牛血清(FBS)，5g/L碳酸氢钠，0.15g/LL-谷氨酰胺，100IU/L青霉素。在该条件下维持稳定的细胞表型细胞并保持较快的增殖活性具有显著优势。

上述原代细胞获取与培养，包括以下步骤:消化所述鼠胚颌突组织，使组织分散成细胞悬液，细胞筛过滤得到原代细胞并培养，其特征在于:所述细胞筛的孔径为75μm滤网。该滤网作为细胞筛，可去除组织碎片及未能成功消化的细胞团块。

上述颅神经嵴源性干细胞的培养方法，还包括以下步骤:将上述细胞悬液离心后，弃上清，加入上述培养基，使细胞重悬后通入细胞筛，其特征在于:离心的转速为800～1000rpm，离心时间为3～5分钟。可有效地进行细胞沉淀，去除消化酶，并保证细胞活性。

上述颅神经嵴源性干细胞的培养方法:所述原代细胞的培养条件为将所述原代细胞置入5%CO2培养箱，在37℃恒温下培养，培养至第2天换液，此后每1-3天进行一次全换液。该条件为体外模拟细胞生长的体内环境，保持细胞的生物学特性。