[发明专利]一种尿液中肌氨酸的衍生化方法

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体地涉及一种尿液中肌氨酸的衍生化方法。

背景技术

肌氨酸即N-甲基甘氨酸，又名2-甲氨基乙酸，化学式为CH₃NHCH₂COOH。肌氨酸有甜味，溶于水。它是胆碱自然代谢为甘氨酸过程中的一个中间体。肌氨酸是蛋白质的重要组成部分，在活细胞代谢过程中起到非常重要的作用。肌氨酸在人体内的基本功能为：（1）增加肌肉细胞的含水量，当所有的肌肉细胞都吸收较多量的水分而增加容积时，肌肉会变得更加饱满、有形；（2）肌氨酸可帮助肌肉细胞储存能量，人体的肌纤维中含有未键结的肌氨酸和带有磷酸根的磷酸肌氨酸，其中磷酸肌氨酸约占了三分之二总肌氨酸的含量。当肌肉收缩产生运动时，身体会利用三磷酸腺苷(ATP)当作其能量来源，但由于人体的肌肉细胞只可提供低于十秒急速收缩所需的ATP能量，必须要有更多的ATP产生才能维持持续的运动，此时存于肌肉中的磷酸肌氨酸会提供磷酸根而使得ATP再次生合成。因此，当肌肉内的肌氨酸较多时，肌肉便有更大的潜在力量得以发挥。

Sreekumar等研究发现，在转移性前列腺癌样本中，有79％样本肌氨酸的水平是显著增高，在局限性前列腺癌样本中有42％的样本肌氨酸水平增加。但在良性前列腺组织中，未测到肌氨酸。这表明在监测前列腺癌进展和侵袭过程中，肌氨酸具有作为前列腺癌标志的潜能。

因此，因此对尿液中的肌氨酸进行检测可提高前列腺癌诊断的敏感性及特异性，有非常重要的意义。

传统的分析肌氨酸的方法主要有氨基酸分析仪、电位滴定分析、高效液相色谱和液/质联用法，这些方法受价格昂贵、灵敏度、选择性等的限制，无法实现普遍应用。气相色谱-低分辨率质谱联用仪（GC-LRMS）因其通用性、可靠性和高性价比，广泛装备于各类医疗检测室和科研实验室，是最容易实现广泛应用的仪器。在常用的GC/MS分析肌氨酸方法中，多采用硅烷化衍生化方法，此衍生化方法干扰多，专一性差，且衍生化产物不稳定。因此开发一种基于GC/MS方法的新型衍生化方法以测定尿样代谢物中肌氨酸成为现实的需要，对于前列腺癌患者的早期诊断和治疗有着重大的现实意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种尿液中肌氨酸的衍生化方法。

本发明提出的一种尿液中肌氨酸的衍生化方法，具体步骤如下： 

（1）将尿液离心，取上清液，用酸调节上清液的pH值为4-5；

（2）将步骤（1）所得的上清液加入阳离子交换柱中，用去离子水充分清洗；

（3）用氨水洗脱步骤（2）中的阳离子交换柱，用安瓿瓶收集洗脱液2-3mL；

（4）步骤（3）所得的洗脱液在45-55℃下用氮气吹干；

（5）在步骤（4）所得的产物中加入50-200 μL甲苯、1-5 mg多聚甲醛固体颗粒和10-30 μL丙烯酸丁酯衍生化试剂，将安瓿瓶封口后混合均匀，随后置于80-150℃下烘箱中反应15-30 min；

（6）步骤（5）所得产物冷却至室温后，加入含叔丁基茴香醚内标的甲醇溶液，混合均匀，取1 μL进行气相色谱-质谱检测。

本发明中，步骤（1）中使用的酸为HCl，浓度是2 mol/L。

本发明中，步骤（5）中烘箱的温度为110-120℃，反应时间为 20 min。

本发明中，步骤（6）中含叔丁基茴香醚内标的甲醇溶液的浓度是0.1μg/μL。

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种新的衍生化反应。该反应是利用肌氨酸与多聚甲醛在甲苯试剂作用下生成1,3-偶极体，1,3-偶极体与丙烯酸丁酯环加成为五元杂环化合物。此衍生反应生成的杂环化合物挥发性好，稳定性强，且由于衍生物是环状化合物，质谱图中的分子离子峰强，易于辨认。

本发明中，肌氨酸的1,3-偶极加成衍生化的反应机制为：

在本发明中，提出了一种新的衍生化方法用于尿液中肌氨酸的定性定量检测，该发明具有很好的创新性，克服了传统硅烷化衍生方法的缺点。反应过程快速、简单、条件容易控制，反应产物单一，稳定性强。同时本发明采用了气相色谱-质谱联用的分析检测技术，具有毛细管色谱的高分离和质谱的精确鉴定等特点，能够准确地对肌氨酸进行定性定量分析，弥补了目前使用的其他检测方法所面临的如仪器昂贵和分析成本较高等缺点，特别适合尿液中肌氨酸的快速定性定量分析。