[发明专利]牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，其特征在于有效成分包括牛病毒性腹泻Ⅰ型病毒灭活抗原以及牛传染性鼻气管炎病毒灭活抗原，优选的，所述的牛病毒性腹泻Ⅰ型病毒灭活抗原为灭活的牛病毒性腹泻病毒NM01株，所述的牛传染性鼻气管炎病毒灭活抗原为灭活的牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株，其中所述牛病毒性腹泻病毒NM01株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6032；所述牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6033。

2.权利要求1所述的二联灭活疫苗在制备预防或治疗牛病毒性腹泻及牛传染性鼻气管炎药物中的应用。

3.一种制备牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的方法，其特征在于包括：将牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型病毒、牛传染性鼻气管炎病毒分别进行大规模培养，收获病毒液，将病毒液灭活后与免疫佐剂混合乳化，制备成灭活疫苗；优选的，所述的牛病毒性腹泻Ⅰ型病毒为牛病毒性腹泻病毒NM01株，所述的牛传染性鼻气管炎病毒为牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株，其中所述牛病毒性腹泻病毒NM01株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6032；所述牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6033。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将细胞系进行传代和培养；

（2）将牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型病毒NM01株和牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株分别接种长满90%～100%传代细胞的介质，用细胞维持液培养，制备生产种毒；

（3）将所制备的生产种毒分别接种长满90%～100%传代细胞的介质，用细胞维持液培养，得到牛病毒性腹泻Ⅰ型病毒NM01株病毒抗原液和牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株病毒抗原液；

（4）将牛病毒性腹泻Ⅰ型病毒NM01株病毒抗原液和牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株病毒抗原液分别加入灭活剂灭活，加入中和剂中和，将两种灭活后的抗原液混合，加入免疫佐剂，乳化，即得；

其中，所述的细胞维持液为含0.5～2μg/ml胰酶及3.5%（v/v）马血清的DMEM培养液或MEM培养液，pH值为7.0～7.2。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述的细胞系包括牛肾细胞系（MDBK细胞系）、牛睾丸细胞（BT细胞系）、牛鼻甲骨细胞系（BT细胞系）、Vero细胞系、BHK21细胞系、牛原代细胞、MDCK细胞系、牛子宫细胞系（NCL-1细胞系）、NCL-1细胞系、兔肾原代细胞（CRL-1414）、兔肾细胞（(LLC-RK1)。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述细胞系的传代和培养包括：将细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，细胞长满90%～100%时，用于继续传代或接种病毒；其中，所述的细胞生长液为含有6%～8%（v/v）的小牛血清的DMEM培养液，pH值为7.0～7.2；所述细胞系的培养方法为以下任意一种：在转瓶中培养，使其细胞密度达到2×10⁵～6×10⁵/ml；或在生物反应器中添加附着载体进行悬浮培养或不添加任何载体进行纯悬浮培养，使细胞密度达到2×10⁶～5×10⁶/ml，所述的附着载体为微载体或纸片。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤（1）、（2）或（3）中所述的培养温度为33～37℃，细胞培养环境是含5%左右CO₂的培养箱或生物反应器或不含CO₂的转瓶；病毒培养时间为30～72小时。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤（2）或（3）中所述的牛病毒性腹泻Ⅰ型病毒NM01株的病毒接种量MOI为0.03～0.05，牛传染性鼻气管炎病毒LN01/08株的病毒接种量MOI为0.01～0.03。