[发明专利]硫藤黄链霉菌抗生素调控基因及提高链霉菌抗生素产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种硫藤黄链霉菌抗生素调控基因及其用途和提高链霉菌抗生素产量的方法。

背景技术

链霉菌是一种极具商业价值的放线菌。在已发现的微生物源抗生素中，产自放线菌的约占2/3，这其中，产自链霉菌的约为80%(Kieser等，2000，Practical Streptomyces Genetics. The John Innes Foundation, Norwich)，它们分别在抗细菌、抗虫、抗肿瘤、抗真菌等方面发挥重要功效。

由于链霉菌的商业价值，提高链霉抗生素产量的方法显得十分重要，这些方法包括两类：一类是通过理化方法对链霉菌进行诱变，在突变株中筛选高产菌株；一类是通过遗传学方法，对菌株进行遗传改变，提高抗生素的产量。通过理化方法对链霉菌进行诱变已经取得了很大的成绩，得到了大量的高产菌株，但是，这种方法的筛选工作量大，而且具有一定盲目性。随着对细菌基因组研究的深入，用遗传学的方法育种降低操作的盲目性，而且使工作量大大降低。

例如，在天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）中，actII-ORF4是抗生素放线紫红素合成的途径专一性正调节因子，可以通过提高它的表达量来提高放线紫红素的产量（Gramajo HC等，1993，Stationary-phase production of the antibiotic actinorhodin in Streptomyces coelicolor A3(2) is transcriptionally regulated. Mol Microbiol.7:837-845）。在灰色链霉菌（Streptomyces griseus）中，ArpA蛋白抑制抗生素的产生，可以通过对arpA基因进行破坏，提高链霉素的产量（Onaka, H.等，1995，Cloning and characterization of the A-factor receptor gene from Streptomyces griseus. J Bacteriol，177:6083-6092）。在阿维链霉菌中，可以通过将aveR1或aveR2基因进行破坏，提高阿维链霉菌中阿维菌素的产量（美国专利US6197591，Stutzman-Engwall）。在棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)中，中断gap基因后导入调控因子ccaR可以提高棒酸的产量（Enhancement of Clavulanic Acid Production by Expressing Regulatory Genes in  gap Gene Deletion Mutant of Streptomyces clavuligerus NRRL3585.J.Microbiol. Biotechnol.(2010),20(1),146–152）。

通过遗传学方法提高链霉菌抗生素的产量，主要是改造调控抗生素产生的调节基因来进行的。这些调节基因，有的起正调节作用，有的起负调节作用，有的可以调节多种抗生素的产量，有的专一调节一种抗生素的产量。对正调节基因，可以通过提高它的拷贝数或者表达量来提高抗生素的产量；对负调节基因，可以通过破坏该基因来提高抗生素的产量；另外，对能同时调控多种抗生素产量的调节基因进行改造比只改造调控单一抗生素产量的调节基因更加有效。

基于上述研究，本发明在硫藤黄链霉菌（Streptomyces thioluteus）中发现了一个全局性调控因子ORF4，可以在不同的抗生素产生菌中提高多种抗生素的产量。生物信息学比对分析显示ORF4为“可能的调节基因”，在现有数据中没有对其功能及作用机制的研究报道，是一个全新的基因。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种新的上调抗生素生物合成的硫藤黄链霉菌抗生素调控基因ORF4及其用途。

本发明的第二个目的是提供一种使用该调控基因上调链霉菌抗生素合成并提高链霉菌抗生素产量的方法，并且利用该方法获得抗生素高产菌株变铅青链霉菌、棒状链霉菌及吸水链霉菌。

本发明所述的新的上调抗生素生物合成的硫藤黄链霉菌抗生素调控基因ORF4来源于硫藤黄链霉菌，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，或与SEQ ID NO：1所示核苷酸编码相同蛋白的核苷酸序列，通过对硫藤黄链霉菌基因组文库进行亚克隆获得，ORF4全长1221bp，包含了一个完整的开放阅读框，编码一个包含406个氨基酸的蛋白质。