[发明专利]反相柱分离纯化硫肽类抗生素诺卡沙星I的方法

说明书

技术领域

本发明涉及反相柱分离纯化硫肽类抗生素诺卡沙星I的方法，属于抗生素分离纯化和精制技术领域。

背景技术

自1928年弗莱明发现青霉素和1942年瓦克斯曼发现链霉素以来，抗生素为人类的健康事业做出了卓越的贡献。在人们应用抗生素治疗疾病的同时，也锻炼了细菌的耐药能力，于是随着抗生素的滥用以及病原性细菌的快速进化，临床上已经出现了越来越多的耐药菌株，特别是对多种抗生素都有抗性的菌株如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐青霉素的肺炎链球菌（PRSP），人们面对这类菌株的快速感染率往往显得束手无策。随着临床上耐万古霉素的革兰氏阳性菌的逐渐增多，万古霉素等糖肽类的抗生素一直以来被作为抗耐药菌的最后防线的地位也变得岌岌可危。于是，寻求并且开发一些结构新颖、活性显著的新型抗耐药菌的药物已经成为新药研究的热点和难点。

诺卡沙星I是由诺卡氏菌属或拟无枝酸菌发酵获得的新型硫肽类抗生素，其结构如式1所示，诺卡沙星I独特结构使其能够通过与核糖体50S大亚基的23S rRNA以及L11蛋白形成复合物从而影响L11蛋白质的构象转化，进而抑制蛋白质的合成而达到杀菌的作用（参见：Nat Prod Rep,1999,16(2):249～263）。其在ng/ml的水平便对绝大多数革兰氏阳性菌特别是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐青霉素的肺炎链球菌（PRSP）、耐万古霉素的肠球菌（VRE）以及具有耐药性的结核杆菌有着超强的杀菌活性，并且有报道指出其对金黄色葡萄球菌感染的小鼠模型也展现出了显著的治愈效果（参见：Antimicrob Agents Chemother,2004,48(10):3697～3701）。因此，在多重耐药菌频繁出现的今天，诺卡沙星I十分具有研究前景及临床应用价值。

诺卡沙星I结构复杂，主要通过微生物发酵提取的方法获得，此途径获得的诺卡沙星I纯度低，无法满足临床前及临床研究的需要，目前主要通过正相硅胶柱层析的方法对诺卡沙星I进行纯化，但这种方法纯化能力有限、回收率低、工作量大、成本高（参见：专利号99898680.0的中国发明专利）。因此，为满足研究及工业化的需要，开发一种便捷、高效、经济的诺卡沙星I纯化方法势在必行。

式1：诺卡沙星I化学结构式

发明内容

针对现有纯化方法的不足，本发明提供了一种高效、快捷、稳定的诺卡沙星I纯化方法。

本发明的技术方案如下：

一种纯化诺卡沙星I的方法，其特征在于，步骤如下：

1、将诺卡沙星I粗品溶解于二甲亚砜（DMSO）中，

2、将溶有诺卡沙星I粗品的DMSO溶液，利用反相硅胶柱梯度洗脱，收集仅有诺卡沙星I的组分，除去有机溶剂，水相用乙酸乙酯或氯仿萃取，萃取液蒸干后得到高纯度诺卡沙星I产品。

上述步骤1中，优选的诺卡沙星I浓度为25-150mg/ml

优选的上述步骤2的柱层析纯化方法，将溶有样品的DMSO溶液加入已平衡的反相色谱柱顶端，打开色谱柱阀门，待样品液进入色谱柱材后加入一定量的洗脱液I进行淋洗，再换成洗脱液II继续淋洗。分段收集洗脱液II的流出液，并用薄层色谱监测，合并含有诺卡沙星I的组分，除去有机相，水相用乙酸乙酯或氯仿萃取，萃取液蒸干后得到产品。

上述步骤2的反相柱层析纯化，优化的诺卡沙星I上样量与硅胶的质量比为1:12000--1:2000。

上述步骤2的反相柱层析纯化，优选的洗脱液I是乙腈和水混合液或甲醇和水混合液。

洗脱液I为乙腈和水混合液时，乙腈的体积分数优选为30-45%。

洗脱液I为甲醇和水混合液时，甲醇的体积分数优选为25-35%。

上述步骤2的反相柱层析纯化，优选的洗脱液II是乙腈和水混合液或甲醇和水混合液。

洗脱液II是乙腈和水混合液时，乙腈的体积分数优选为35-50%。

洗脱液II是甲醇和水混合液时，甲醇的体积分数优选为40-50%。

进一步地，所用反相硅胶，粒径为20-45μm，40-75μm和70-200μm中的一种或混合物。

本发明方法的优良效果如下：

1.本发明所涉及的纯化方法操作简单，重复性好。仅通过一步反相柱层析和萃取等常规操作即可获得高纯度诺卡沙星I。

2.本发明涉及的纯化方法效率高，产品质量高。采用本发明的纯化方法，诺卡沙星I的产率高达85%以上，纯度大于98%。