[发明专利]一种用于牛结核病诊断的真核表达CFP10-ESAT-6融合蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及一种结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合蛋白，该蛋白为酵母表达系统真核表达所得，在牛结核病诊断中显示较好的应用前景。

背景技术

牛结核病主要由牛型分枝杆菌感染牛引起的一种慢性细菌性疾病，也可感染人类和其他一些动物引起相应疾病，被国际兽医局（OIE）列为需通报的动物疫病。牛结核病直接影响牛的生产力及产品的国际贸易，造成巨大的经济损失，同时其作为一种重要的人兽共患病，也是公共卫生的重大威胁。虽然大部分发达国家由于采取“检疫-扑杀”的根除策略和强大的经济支撑，牛结核病流行率已降至很低水平，但至今尚无任何国家获得OIE“无结核”认可。另外，牛结核病在许多发展中国家仍十分流行，近年来随着养牛业突飞猛进的发展，我国一些地区的发病率也呈上升趋势。因此，如何有效预防和检测牛结核具有重要的经济和社会意义。

鉴于分枝杆菌感染初期机体的免疫应答主要以细胞免疫为主，故牛结核的检疫主要通过细胞免疫应答为基础的检测手段，包括结核菌素皮内变态试验（TST）和抗原特异的γ-干扰素（IFN-γ）检测试验。其中TST是OIE指定也是应用最普遍的牛结核检测方法，但其敏感性和特异性受限。IFN-γ检测法主要检测特异性抗原体外刺激全血后产生的IFN-γ水平，但主要是作为TST的辅助检测手段。两种方法均使用到结核菌素纯化蛋白衍生物（PPD），PPD由分枝杆菌培养物灭活提纯得到，成分复杂，其特异性易受交叉反应影响，经常造成诊断结果的假阳性，给生产带来一些不必要的损失。因此探索特异、敏感的检测抗原对控制牛结核有重要意义。

CFP10和ESAT6是结核分枝杆菌感染早期细胞介导免疫应答的主要优势抗原成分之一，编码这两种蛋白的基因只存在于结核分枝杆菌复合群（包括人型、牛型、非洲分枝杆菌等）及少数几种其他分枝杆菌中，而所有BCG菌株都缺失这两种基因。因此，这两种蛋白有望成为临床区分牛结核与禽结核感染以及区分自然感染与疫苗免疫的理想诊断抗原。国内外有关该种蛋白在结核病TST和IFN-γ检测试验中的研究均显示其较高的敏感性和特异性。但已有研究多利用大肠杆菌原核表达系统表达，缺少许多蛋白在翻译后所需的磷酸化、糖基化等修饰加工机制。与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，既有生长快、易于培养、遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物对表达的蛋白进行正确加工、修饰、合理的空间折叠等功能，非常有利于高活性蛋白的表达。本发明通过构建真核表达cfp10-esat6融合基因的重组毕赤酵母，获得胞外分泌表达的CFP10-ESAT6融合蛋白，其在牛结核病诊断中显示出相对原核表达蛋白更高的敏感性和特异性。

发明内容

本发明为了克服原核表达系统表达蛋白的一些不足，利用酵母系统真核表达重组融合蛋白CFP10-ESAT-6，并将其应用于牛结核病临床诊断，提高检测结果的灵敏度和特异性。

本发明所述真核表达的CFP10-ESAT-6蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该蛋白通过以下方法获得：是通过酵母表达系统进行真核表达和纯化，过程为：将cfp10-esat6片段插入pCR2.1-T载体转化大肠杆菌DH5α，经PCR、酶切及测序筛选出阳性克隆；用EcoR Ⅰ与XbaⅠ酶切、回收和连接cfp10-esat6与pPICZαA片段，构建重组质粒pPICZαA-cfp10-esat6，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并转化毕赤酵母GS115，筛选阳性转化子；甲醇诱导表达重组毕赤酵母，上清液浓缩后进行纯化，并对纯化蛋白进行分析与鉴定，鉴定分析显示所得即为CFP10-ESAT-6蛋白。

本发明所述CFP10-ESAT-6蛋白作为刺激原，用于牛结核病临床诊断。该应用是通过以下技术方案达到：

（1）CFP10-ESAT-6蛋白的皮内变态反应试验

试验操作方法同OIE规定的牛结核皮内变态反应试验操作流程，每头牛CFP10-ESAT-6蛋白注射量为40μg。

（2）CFP10-ESAT-6蛋白的IFN-γ检测试验

将CFP10-ESAT-6蛋白作为刺激原，工作浓度为5μg/mL，依照BOVIGAM^TM Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle说明书检测奶牛血浆样品中IFN-γ水平。