[发明专利]牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及到重组细菌疫苗领域，特别涉及一种牛布鲁氏菌（Brucella abortus）重组菌株S19-Δbp26-BL及其制备方法与应用，该菌株是在缺失其bp26基因的位置插入自身两个主要免疫原性基因BLS和L7/L12得到。

背景技术

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人兽共患传染病，防控该病一直是以应用疫苗进行预防为主。布鲁氏菌疫苗种类较多，重组蛋白疫苗与DNA疫苗保护性有限，灭活疫苗保护期短。目前用于布鲁氏菌病防控的减毒菌株主要有国外的牛型19号弱毒菌株（S19）和羊型ReV.1弱毒菌株，国内研制的羊型5号（M5）弱毒菌株和猪型2号（S2）弱毒菌株。弱毒苗造价便宜，免疫保护持续时间长，免疫保护效率高，但是这些弱毒疫苗同样存在缺陷。这些光滑型布鲁氏菌弱毒疫苗免疫动物后，会在动物机体诱导产生S-LPS抗原“O”链特异性抗体，很难与野毒株布鲁氏菌感染相区分，干扰常规布鲁氏菌病的诊断。如果广泛应用这样的疫苗就对该病流行病学调查、探查疫源产生很大的障碍。许多国家与地区限制布鲁氏菌血清学方法检测呈阳性动物的肉制品、奶制品进出口，给国际贸易产生严重的阻碍，特别是对牧区经济产生重要的影响。除此之外，现有的布鲁氏菌的减毒活疫苗都对动物会产生不同程度的副作用，再引起动物轻度流产的同时也会感染人类。所以构建安全性高、无返祖、能区分自然感染与人工主动免疫、保护性能好的布鲁氏菌标记弱毒疫苗是当务之急。

BP26蛋白是一种具有强免疫原性的外周浆蛋白，且几乎存在于所有布鲁菌菌株中。研究表明BP26蛋白具有良好的免疫活性，自然感染或人工免疫后都可以在血清中检测出针对此抗原的特异性抗体。bp26基因的缺失对布鲁氏菌的毒力和免疫原性几乎没有影响，并不会影响细菌本身的生长繁殖。

L7/L12编码的核蛋白在布鲁氏菌的核糖体亚单位中以四个拷贝的形式存在，其氨基末端可与L10核糖体蛋白形成二聚体，羧基末端在多肽合成的延伸过程中，可以与延伸因子EF-TU和EF-G相结合，并在GTP水解过程中发挥重要作用。研究发现，从布鲁氏菌中提取的L7/L12蛋白能特异性地刺激感染动物的单核细胞，并上调INF-γ的转录和表达，从而起到保护作用。BLS编码2,4-二氧四氢蝶啶合成酶，此蛋白酶以二聚体的形式形成五聚物，60个亚单位可以排列成20面体衣壳形式，有类似于霍乱毒素（CT）的佐剂作用，而在安全性和激活Thl型为主的免疫反应方面BLS又强于CT，BLS重组质粒免疫动物，可产生IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM等多种特异性抗体，用布鲁氏菌544A攻毒，可显著降低细胞负荷。2007年，Juliana Cassataro（Improved Immunogenicity of a Vaccination Regimen Combining a DNA Vaccine Encoding Brucella melitensis Outer Membrane Protein31(Omp31)and Recombinant Omp31Boosting.Clin Vaccine Immunol.2007,14(7):869–874.）等，将Omp31的loop区的27个氨基酸连于BLS，重组蛋白免疫B1LB/c小鼠，用绵羊附睾型布鲁氏菌攻毒，保护性与ReV.1疫苗相当，可见BLS不仅有特异性的免疫保护，还有佐剂效应。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL。

本发明的再一目的在于提供上述牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL在制备用于治疗和/或预防布鲁氏菌病的疫苗中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法，包括以下步骤：

（1）自杀性同源重组质粒的构建

①以牛布鲁氏菌S19基因组DNA为模板做PCR扩增，用引物P1和P2扩增，得到bp26基因的上游同源臂；用引物P3和P4扩增，得到bp26基因的下游同源臂；用引物B1/B2扩增，得到BLS基因；用引物B3/B4扩增，得到L7/L12基因；

P1：5’-GATGGTACCCGATGCAGCAAGACAGTATT-3’（横线部分为KpnI酶切位点）；