[发明专利]HCMV pp65原核表达重组菌株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于领域基因工程领域，具体涉及病毒蛋白的表达。

背景技术

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus, HCMV)为一种核酸大小约235kb的双链DNA病毒，直径约200nm，衣壳由162个壳粒组成，外有包膜包被，属疱疹病毒科β属，也是疱疹病毒中最大的病毒。HCMV的感染非常普遍，在我国，成年人群感染率可达60%～100%^[1]，而在发达国家中，人群感染率为也高达40%～60%，通常在健康人群中呈潜伏性感染，无明显临床症状，但在免疫功能低下的个体如器官移植、艾滋病、恶性肿瘤等患者中，HCMV可导致严重的感染。有研究表明，HCMV活动性感染是器官移植失败和艾滋病死亡的主要原因^[2,3]。同时，HCMV是一种最常见的引发婴幼儿先天性感染的病毒，据统计，在欧美新生儿HCMV先天性感染率为0.2%～2.2%^[4]，其中出生时伴有症状者占10%～15% ，无症状的但遗留后遗症的感染婴儿占10%～15%；而我国，胎儿先天性HCMV感染率达3.5%^[5]，其中病死率为10%～30%，而存活患儿一般均伴有遗留症状如智力低下、神经性耳聋等，概率高达90%以上^[6]。因而，建立早期快速诊断HCMV感染的方法则显得十分必要。国外普遍采用pp65抗原血症检测法，也是现在最可靠的方法^[7]，而目前国内主要以检测血清中抗体为主，pp65蛋白为HCMV表达的一种早期结构蛋白，是表明HCMV活动性感染的一项早期指标。

HCMV pp65蛋白是HCMV早期产生的一种结构蛋白，在激活状态的HCMV感染时，pp65蛋白于6～24 h内表达于外周血淋巴细胞、单核细胞、多形核白细胞和血管内皮细胞，是HCMV活动性感染的一项早期指标。目前国内诊断常使用HCMV全病毒为抗原，由于成分复杂且本身存在与单纯疱疹病毒的交叉抗原，使之特异性低，而以pp65蛋白代替全病毒作为抗原则能很好的弥补这一缺陷，通过pp65抗原血症检测病毒活动与否，是目前被广泛接受的相对“金标准”^[8]。据文献报道，pp65蛋白包含激发CTL、Th免疫和绝大部分B细胞识别的抗原表位，这些表位大部分均位于pp65蛋白的第360～503位氨基酸^[9,10]。

目前已有的pp65蛋白相关抗原表位研究都是围绕其优势抗原表位而展开的，因此还没有pp65新表位的研究报道，pp65蛋白共有多少个抗原表位、抗原表位的定位、是否含有其它强构象抗原表位等都为研究的盲区。国内也有其他研究者进行了关于pp65重组蛋白的研究，但大部分只针对优势抗原表位进行重组表达，有可能漏掉一些目前还没有发现的重要新表位，降低了重组蛋白的抗原性和免疫原性。

利用基因工程技术进行重组蛋白的表达应用最多的为大肠杆菌表达系统^[11]，主要是因为人们对其遗传背景、分子生物学特点等方面已有了较深的认识，许多目的基因在大肠杆菌中都能迅速有效的表达目的蛋白，加之其培养条件简单、易于控制，因而该表达系统已被广泛应用。国内有研究人员曾利用毕赤酵母进行pp65的重组表达^[12]，但是表达量都不高，且培养周期比较长。

参考文献

[1] 阮光萍, 王小宁. 巨细胞病毒疾病的研究进展[J]. 国际检验医学杂志, 2006, 27(1): 81-83.

[2] 赵杨, 陈敦金, 闻良珍. 人巨细胞病毒基因时序表达对感染结局的影响[J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2004, 24(10):834-838.

[3]Doesch AO,Repp J,Hofmann N,Erbel C, et al. Effects of oral valganciclovir prophylaxis for cytomegalovirus infection in heart transplant patients[J]. Drug Des Devel Ther. 2012; 6: 289-295.