[发明专利]基于重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明属于医学检验测定技术领域，特别是涉及基于重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法。 

背景技术

牛结核病（tuberculosis,TB）是由牛结核分枝杆菌引起的慢性消耗性疾病，呈世界性分布。世界动物卫生组织（OIE）将牛结核病列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。一直以来，人们习惯认为牛结核病在水牛中很少发生，但1998~2000年南非克罗格国家公园爆发了以水牛为自然宿主的牛结核病，公园南部的水牛感染率达42%，中部地区的感染率为21%，给人们提示了水牛感染结核病的严重性。近年来我国南方奶水牛业的快速发展，尤其是广西、云南、贵州、四川等地掀起了饲养奶水牛的热潮。由于水牛奶干物质含量高达18.4%，比黑白花牛奶的含量高出1/3多；其中乳脂率含量为7.9%，高出黑白花牛奶一倍多，水牛奶在人们的日常生活中的地位越来越重要。随着水牛集约化养殖程度的提高，水牛养殖密度的增加，尤其是从国内外引种交易的频繁以及检疫的不严格，增加了水牛结核病发生的可能性，全国水牛结核病的流行具有上升与蔓延趋势。我国亦不断有水牛结核病发生的报道，但对水牛结核病的检测由于没有适合的方法而一直是沿用牛结核病的检测方法，均不适用于水牛结核病的检测。 

到目前为止，我国国标推荐的牛结核病诊断方法只有细菌学检查和结核菌素(PPD)皮内变态反应。细菌学检出率低，培养周期长，不适于大规模普查。皮内变态反应的应用最为广泛，该法技术要求不高，但工作量大，检出时间长，操作麻烦，许多因素都可以降低该方法的敏感性和特异性。γ-干扰素（IFN-γ）主要是由抗原、有丝分裂素等一些细胞因子活化T淋巴细胞和NK细胞产生，是免疫调节活性最强的一类干扰素。经结核杆菌抗原致敏的T淋巴细胞，在再次遇到相同抗原时，将在短时间内产生IFN-γ，因此高水平的IFN-γ即可表明有结核杆菌感染。国外Wood等首先将抗原特异性的IFN-γ试验用于牛结核病的检测，澳大利亚选用牛IFN-γ试验为牛结核病根除计划的大规模筛选试验，已于1997年12月宣布消灭了牛结核病；此外，爱尔兰、新西兰等国也批准牛IFN-γ试验为正式试验。 

经过对检索有关于牛结核病检测试剂的研究报道，国内牛结核病检测的现有技术情况如下：（1）华中农业大学、中国农业大学对抗牛IFN-γ试验单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立进行了研究；扬州大学建立了牛γ-干扰素抗原捕获ELISA检测方法，建立了竞争抑制ELISA方法和胶体金试纸条检测牛γ-干扰素。但扬州大学建立的方法采用牛分支杆菌抗原PPD作为刺激物，临床诊断中难以与禽分支杆菌等环境分支杆菌感染区分开，特异性较差。（2）中国农业大学申请的专利（申请号201110034194.3）牛分支杆菌检测试剂使用单个重组蛋白MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的混合物，中国农科院北京畜牧兽医研究所申请的专利（申请号201210147678.3）牛结核病检测试剂亦使用单个重组蛋白CFP-10、ESAT-6和TB10.4，单个抗原混合使用在抗原表达与纯化、相互配比及方法的标准化等方面均存在明显不足；中国农科院哈尔滨兽医研究所申请的专利(申请号200510005002.0)使用牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83和ESAT6融合蛋白用于牛结核病的检测，忽视了CFP-10和ESAT-6是紧密异二聚体结构的特点，在检测灵敏度方面略有欠缺。γ-干扰素水平成为了牛结核病的判断标准，而国内对γ-干扰素检测方面的研究存在一定的局限性，例如灵敏度和特异性差、检测周期长、检测方法仅限用于黑白花奶牛、不适于大规模普查等问题。 

本发明人通过对1500余头奶水牛进行PPD皮内变态反应临床试验，其结果显示，2岁以下的水牛术前皮厚平均值在20mm左右，3~5岁的水牛术前皮厚平均值在17.5mm左右，5岁以上水牛的平均值在18.5mm左右。用PPD作为抗原进行水牛皮内变态反应，皮厚差大于2mm的水牛占到20%左右，其中皮厚差大于4mm的水牛占到10%左右，按照国标（GB/T18645-2002.动物结核病诊断技术）其检出的阳性率异常高。然而，PPD检测阳性水牛用IFN-γELISA试验复检，其阳性率通常不足5%。该检测结果让我们认为直接参照现行国标用PPD进行水牛结核病检测，以2mm皮厚差以下判断阴性的标准是不适用于水牛结核病检测的。有关报道显示，奶水牛以及水牛群已经处于结核病感染的状态，急需开发出一种可用于快速检测牛全血中γ-干扰素分泌水平的方法，实现水牛结核病的防控。 

发明内容