[发明专利]基于基因工程策略优化耶氏解脂酵母重组菌合成共轭亚油酸

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程手段对耶氏解脂酵母重组菌进行优化从而提高共轭亚油酸产量，具体是对合成共轭亚油酸的重组耶氏解脂酵母菌株进一步优化。

技术背景

共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）是由一系列含有碳9、碳10、碳11开始的共轭双键、具有位置和几何异构的十八碳二烯酸构成的。近30年来，由于CLA具有包括抗癌、抗动脉粥样硬化、免疫系统的调节以及抑制脂肪的积累等对人类健康有益的效果，而被广泛的研究。c9，t11-CLA、t10，c12-CLA是含量最多并且是迄今为止确认具有生理活性功能的三种共轭亚油酸单体（还包括t9，t11-CLA）中的两种。CLA存在于多种动、植物及人体组织中，特别是反刍动物乳制品中，但其含量较低。通过将红花籽油或葵花籽油碱催化异构法等化学方法合成的CLA异构体的混合物，具有活性功能的异构体较难从中分离纯化。而通过生物转化法来获得成分单一的功能CLA是目前的一个前沿技术，能够满足CLA在医药及营养领域的应用要求。

到目前为止，c9，t11-CLA生物合成的最高量是Delacroixia coronata菌株通过delta-9脱饱和酶作用将t-亚油酸转化成CLA，浓度最高达到10.5mg/ml。转基因烟草种子以及大米中t10，c12-CLA占总脂肪酸的量仅分别为0.3%及1.6%。相对而言，生物合成t10，c12-CLA具有很大的提升空间。亚油酸异构酶（PAI）可以将游离亚油酸（LA）催化为共轭亚油酸。在之前我们的研究中通过优化PAI基因成功实现了在耶氏解脂酵母（Yarrowia lipolytica，Y.lipolytica）重组菌株中的异源表达，并在重组菌株的脂肪酸组分中检测到了产物t10，c12-CLA，利用多拷贝整合进一步提高了PAI基因在Y.lipolytica中的表达量及t10，c12-CLA产量，CLA产量占总脂肪酸量的5.9%。但此重组菌株的t10，c12-CLA产量还远远不能满足实际应用的要求。在Y.lipolytica细胞中，LA不只是PAI的底物，它也会参与到脂肪酸贝塔氧化等代谢途径中，这些途径中的相关酶和PAI之间存在竞争关系，因此无论是PAI表达量的提高还是LA的增多都会使更多的LA流向CLA合成通路。来源于本实验室高山被孢霉（Mortierella alpine ATCC32222，M.alpineATCC32222）的delta-12脱饱和酶基因（FADS12，d12）具有较广的适配性，无论酵母还是丝状真菌均能成为其表达宿主，delta-12脱饱和酶是将OA转化为LA的脂肪酸脱氢酶，可进一步提高菌体内LA的含量。另外培养基中添加一些植物油也可使底物LA的含量大大提高。

所以本发明通过基因工程的方法来改造Y.lipolytica重组菌株，提高PAI基因表达量和底物亚油酸(LA)的含量，并且培养基中额外添加LA含量较高的大豆油，达到了用微生物法高产t10，c12-CLA的目标。

发明内容

本发明的目的是通过基因工程及发酵手段提高耶氏解脂酵母重组菌株中PAI的表达量以及底物LA的量，从而提高t10，c12-CLA专一异构体的产量。

本发明涉及含有opai/d12共表达基因的重组表达质粒，所述质粒可以是pJU16-opai-d12。

本发明另外一方面还涉及含有所述的重组表达质粒的宿主细胞，宿主细胞中包含的质粒可以是单拷贝或多拷贝的，例如1-8个拷贝，优选4个、5个、6个、7个或8个拷贝，最优选8个拷贝，所述宿主细胞可以是耶氏解脂酵母菌，例如CCFM-JUL系列菌，优选CCFM-JUL277。

本发明还涉及利用所述的重组表达质粒或所述的宿主细胞在生产共轭亚油酸中的用途，所述的共轭亚油酸是t10，c12-CLA，通过发酵所述宿主细胞，并在大豆油培养基中进行发酵可制备生产共轭亚油酸t10，c12-CLA专一异构体，具体发酵培养条件如下：CCFM-JU277-9菌株活化后，将种子液按5%接种量转接至5LYN₂₀BDS培养基中，28℃发酵，发酵时间为30-45小时，优选的发酵时间为40小时。