[发明专利]一种优秀冰雪运动员骨骼肌卫星细胞体外分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及优秀冰雪运动员骨骼肌卫星细胞体外分离培养技术，属于运动创伤学、细胞生物学、组织工程学交叉学科领域。

背景技术

骨骼肌卫星细胞(skeleton satellite cell，SCC)是目前公认的骨骼肌干细胞，是位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖分化潜力的肌源性细胞。1961年，Mauro描述了一个与青蛙肌纤维细胞边缘紧密相连的细胞，并根据其位置命名为卫星细胞，它们在一般情况下是处于静息状态的，当被激活后，具有增殖分化、融合成肌管、再形成肌细胞的能力。负责骨骼肌生长和损伤修复。2008年，Nature杂志刊登由美国斯坦福大学医学院的Sacco等人的研究结果：研究小组通过利用克隆分析证实卫星细胞的确是干细胞、能够自我更新，从而澄清了相关问题。他们将一个表达荧光素酶的卫星细胞移植进了小鼠的肌肉中，发现它能够大量增殖，有助于肌肉纤维的形成，而且可以被再次移植。若该干细胞治疗应用技术得以突破，必定会为人类骨骼肌损伤修复在临床康复治疗带来了新的希望。

在现代体育运动中，冰雪运动是一个高风险的运动，运动员发生肌肉损伤几乎不可避免，当优秀冰雪运动员发生损伤后，一方面运动员自身承受着巨大的身心压力，另一方面也是其所从事的项目上的重大损失。怎样科学地选择运动员骨骼肌损伤后的治疗康复手段已成为现今医学工作者和体育工作者热切关注的问题，以往组织病理学的观点认为，人体成熟的骨骼肌细胞属于终末分化细胞，已经不再具有分裂和再生的能力，一旦因为某种原因遭受破坏，就会成为永久性的功能和组织的缺失，被纤维化的瘢痕组织所代替，不在具有收缩能力，使其运动能力减弱或丧失。同时，传统的治疗手段，如开放性手术治疗，因其副损伤和术后并发症常常给运动员重回巅峰竞技水平带来不可预知的风险。近年来，关于骨骼肌卫星细胞移植到骨骼肌中用来治疗肌肉组织缺损或肌肉功能障碍的研究不断出现新的成果，并且随着组织工程技术的发展，应用肌组织工程技术，进行骨骼肌再生代替以往的手术方法治疗运动员骨骼肌损伤的手段固然是更为科学的选择。

目前，骨骼肌细胞移植技术还处于基础研究阶段，使得体外分离培养人骨骼肌卫星细胞在骨骼肌损伤后的治疗和康复领域具有很重要的临床和现实意义。因此，优秀冰雪运动员骨骼肌卫星细胞体外分离培养方法能够为骨骼肌细胞移植技术提供丰富的研究材料，能够为骨骼肌伤病的冰雪运动员带来治疗康复的新希望。

发明内容

本发明目的是提供一种优秀冰雪运动员骨骼肌卫星细胞体外分离培养方法。骨骼肌卫星细胞样本采集均经优秀冰雪运动员本人及隶属单位同意。

为实现上述目的，本发明采取以下实验方案：

(1)优秀冰雪运动员骨骼肌样本的采集；

(2)优秀冰雪运动员骨骼肌卫星细胞分离培养；

其中，步骤(1)样本的采集来自优秀冰雪运动员三角肌肌肉组织活检；步骤(2)中采用0.9％无菌生理盐水清洗肌肉组织；步骤(2)中采用1％I型胶原酶及0.1％链酶蛋白酶联合消化分离骨骼肌卫星细胞；步骤(2)中采用含10％胎牛血清高糖DMEM培养基培养；步骤(2)中采用0.25％胰蛋白酶消化骨骼肌卫星细胞传代培养；步骤(2)中采用DMEM基础培养基+二甲基亚砜+胎牛血清(比例为5∶1∶4)进行骨骼肌卫星细胞冻存。

具体实施方式

(1)取优秀冰雪运动员三角肌活检组织3mm³；

(2)用0.9％无菌生理盐水清洗两遍；

(3)用1％I型胶原酶消化30min；

(4)用0.1％链酶蛋白酶消化30min，用不同规格滴定管吹打使卫星细胞与基膜分离；

(5)用含10％胎牛血清高糖DMEM培养基终止消化，用400目细胞筛过滤，500g离心5min。

(6)弃上清，高糖DMEM培养基重悬，接种贴壁培养。

(7)待骨骼肌卫星细胞贴壁汇合率至95％时用0.25％胰蛋白酶消化传代培养。

(8)骨骼肌卫星细胞冻存采用冻存液DMEM基础培养基+二甲基亚砜+胎牛血清(比例为5∶1∶4)冻存。