[发明专利]一种提高蛹虫草虫草素含量的原生质体诱变选育方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物菌种的诱变选育技术领域，特别涉及一种原生质体亚硝基胍诱变选育虫草素高产菌株的方法，依据此方法可以选育获得高产虫草素的菌株。

背景技术

[0002] 蛹虫草(Cordyceps militaris)，又名蛹草、北冬虫夏草、北虫草，为子囊菌亚门、核菌纲、麦角菌目、麦角菌科、冬虫夏草属真菌，是蛹草拟青霉（Peacilomyces militaris）的有性型，其功效与冬虫夏草类似，在药化、药理和临床试验中证明与冬虫夏草十分相似，在功能食品、医药和生物学技术方面有很好的实用价值。蛹虫草作为新资源食品和中药新药（中药国药准字Z20030034/35）已获卫生部和国家食品药品监督管理局批准进入市场，在日本、韩国等已将蛹虫草作为冬虫夏草的代用品应用于药品、保健食品的开发。蛹虫草中的药效成分主要有虫草素、腺苷、虫草酸、多糖等，同时含有多种人体必需氨基酸和微量元素。

虫草素（Cordycepin）即3’-脱氧腺苷，又称虫草菌素、蛹虫草菌素。它是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素，是蛹虫草以腺苷为直接前体合成的一种重要次生代谢产物。虫草素的分子式为C₁₀H_l3N₅O₃，分子量为251Da，熔点为230～231℃，溶于水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，紫外光的最大吸收波长为259nm。大量研究表明，虫草素具有调节机体免疫、抗肿瘤、抗真菌、抗病毒、抗白血病、降血糖、降血脂等方面的作用，在治疗白血病方面已由FDA批准进入了临床研究。虫草素主要来源于蛹虫草子实体，但由于固体栽培蛹虫草周期长，子实体生长缓慢，产量低，虫草素含量更低，导致其生产成本过高，市场中只有少量的虫草素供应，市场价格昂贵。随着虫草素在医药保健领域的应用和有关产品的开发，市场需求量大增。故蛹虫草产量和虫草素的含量已经成为制约虫草素进一步研究和开发利用的瓶颈。目前蛹虫草已实现了大规模深层液体通气发酵，但因自然界原始菌株的虫草素产量往往不高，虫草素的单位产量仍然很低，这大大制约了其开发应用。故开展高产虫草素蛹虫草菌株的诱变，提高虫草素的含量有重要意义。

诱变育种现已成为提高蛹虫草虫草素含量的普遍应用的育种方法之一，常规诱变育种多采用物理诱变如紫外线等或化学诱变剂如硫酸二乙酯、氯化锂等对菌丝或孢子进行诱变处理，因这类诱变方法因孢子或菌丝对诱变剂敏感性差、单孢子分离困难、选育耗时长，难以获得理想的诱变效果。而原生质体作为诱变材料，具有较多优越性：一是去壁后的原生质体，诱变剂更容易进入，可以快速作用于细胞核DNA，诱变效果明显；二是原生质体彼此分离，更有利于同诱变剂接触；三是原生质体在释放过程中多为单核，克服了菌丝多核的缺点，诱变后不易发生分离现象。因此本发明采用亚硝基胍对制备的蛹虫草原生质进行高效诱变，取得了显著的效果。

发明内容

本发明针对蛹虫草常规育种中技术上的上述缺陷，提供一种设备简单、操作方便、成本低、诱变效率高的蛹虫草诱变方法，采用该方法诱变，可以提高蛹虫草的诱变效率并降低诱变成本。为实现上述目的，本发明所述的蛹虫草菌株诱变选育方法，包括以下步骤：

（1）菌株活化培养 将实验室保藏的蛹虫草菌株转接到PDA固体斜面培养基进行活化培养。

（2）菌株菌丝固体培养 从活化好的斜面试管上刮取培养好的菌丝体接种于蛹虫草固体琼脂平板培养基中培养菌丝。

（3）液体菌丝体培养 从培养好的菌丝固体培养基上取菌块接种到液体培养基中，进行恒温震荡培养。

（4）菌丝体酶解 所用的原生质体稳定剂为0.6 mol/L的MgS0₄?7H₂0和相同浓度的甘露醇溶液按照体积比1:1混合后的溶液；

       菌丝酶裂解液配制方法为：分别称取蜗牛酶及纤维素酶，溶解于0.6mol/L的渗透压稳定剂中，使两种酶的浓度分别达到0.6%和1.2%(W/V)，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，然后按照2:1的体积比混合备用；

培养好的菌丝体无菌滤纸过滤，并置于无菌离心管中，用以上渗透压稳定溶液洗涤3次，将多余的水分用无菌滤纸吸干；