[发明专利]一种测定草坪草内源激素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物内源激素的测定领域，具体地，涉及一种测定草坪草内源激素的方法。

背景技术

自20世纪70年代采用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）分析植物内源激素以来，由于其具有灵敏度高和选择性、重复性好及分析速度快等特点，已在除乙烯外的四大类植物激素和生长调节剂的研究领域中得到不断发展。利用高效液相色谱对植物内源激素进行定量测定的重点在于选择出合适的内源激素提取方法和色谱条件。但因生物体内源激素的复杂性和特殊性，目的成分的分离提取是极为关键的一步，而且是直接影响其精密度、回收率的重要因素。传统的利用高效液相色谱法测定植物内源激素的方法，通常是利用80%的冰甲醇来提取植物内源激素，然后过滤，收集滤液，利用旋转蒸发仪蒸干，用少量水溶解残液，冻融过夜，融化后，离心取上清液，调节pH，加乙酸乙酯萃取，取有机相，然后再旋转蒸发，最后用流动相溶解，上样。这种方法不但操作复杂，而且回收率相当低（约为80%），不利于准确地测定植物内源激素含量。

因此，选择出合适的内源激素提取方法和色谱条件，对于测定植物内源激素，尤其是草坪草内源激素的含量将有重大的意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种测定草坪草内源激素的方法。

本发明提供的测定草坪草内源激素的方法，包括以下步骤：

1）将草坪草用磷酸钠缓冲液和二氯甲烷进行两次提取，两次离心后，然后氮气吹干，得到草坪草内源激素；

2）将步骤1）得到的草坪草内源激素用甲醇溶解后，利用固相萃取柱进行脱色脱脂，取洗脱液，然后真空抽干后，再用甲醇和乙酸的混合溶液溶解；

3）以甲醇和乙酸作为流动相，利用高效液相色谱对经过步骤2）处理后的草坪草内源激素进行测定，得到草坪草内源激素的含量。

其中，步骤1）中，所述磷酸钠缓冲液的浓度为0.05M，pH值为7.0，还含有0.02%～0.05%（w/v，优选0.02%）的二乙基二硫代氨基甲酸钠。w/v为质量体积比，即磷酸钠缓冲液中含有0.02～0.05%二乙基二硫代氨基甲酸钠指：100mL磷酸钠缓冲液中含有0.02～0.05g二乙基二硫代氨基甲酸钠。二乙基二硫代氨基甲酸钠作为抗氧化剂，可以起到避免提取出来的草坪草内源激素被空气氧化的作用。

其中，步骤1）中，草坪草与磷酸钠缓冲液的质量体积比为1:8～1:12，优选1:10（g:mL）。

其中，步骤1）中，磷酸缓冲液与二氯甲烷的体积比为3:4～1:1，优选1:1。

其中，步骤1）中，用磷酸钠缓冲液进行提取的条件包括：在4°C下提取0.8～1.2h后，用1M盐酸调pH至2.5～3.0，优选为：在4°C下提取1h后，用1M盐酸调pH至2.6。

其中，步骤1）中，用二氯甲烷进行提取的条件包括：在4°C下提取0.8～1.2h；优选为：在4°C提取1h。

其中，步骤1）中，两次离心的条件包括：在8000～12000rpm下离心8～15min，取下清液，残渣再用二氯甲烷进行提取，在8000～12000rpm下再次离心8～15min，合并下清液。优选为：在10000rpm下离心10min，取下清液，残渣再用二氯甲烷进行提取，在10000rpm下再次离心10min，合并下清液。

进一步地，残渣再用二氯甲烷进行提取，提取的条件与首次利用二氯甲烷提取（用磷酸钠缓冲液进行提取后）的条件相同，包括：在4°C下提取0.8～1.2h；优选为：在4°C提取1h。

经过本发明步骤1）提取草坪草，得到的草坪草内源激素主要含有：ABA（脱落酸）和IAA（吲哚-3-乙酸），再用后续的步骤测定它们的含量。

其中，步骤2）中，溶解草坪草内源激素的甲醇的浓度为80%。

其中，步骤2）中，固相萃取柱具体可以为：C₁₈固相萃取小柱。

其中，步骤2）中，利用固相萃取柱进行脱色脱脂，收集洗脱液的条件包括：先用甲醇活化固相萃取柱，再用浓度为80%的甲醇平衡；然后上浓度为80%甲醇溶解的草坪草内源激素样品，再用浓度为80%的甲醇洗脱，收集洗脱液，35°C真空抽干。

其中，步骤2）中，甲醇和乙酸的混合溶液中，甲醇和乙酸的体积比为2:1～1:1，优选1:1。乙酸的浓度为0.075%。