[发明专利]一种拟除虫菊酯类农药通用包被抗原的合成及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种拟除虫菊酯类农药通用包被抗原的合成及应用，合成的抗原用紫外分光光度法进行鉴定，并将其用于酶联免疫分析和胶体金免疫层析试纸条的制备，属于生物化工技术领域。

背景技术

拟除虫菊酯类农药，英文名称Pyrethroid insecticides，是一类在天然除虫菊酯化学结构研究基础上发展而来的仿生杀虫剂，具有灭虫速度快、残效时间短、对高等动物及鸟类毒性低，使用安全等优点，被广泛用于茶园、果园、牧业和家庭的害虫防治，因此，拟除虫菊酯类农药已成为现代杀虫剂的主要支柱产品之一。但长期大量地施用该农药，造成了严重的环境污染和食品安全隐患。同时研究表明，拟除虫菊酯类农药对于鱼、虾、鳖等水生生物的毒性比较大。因此，建立拟除虫菊酯类农药残留的快速检测技术，具有十分重要的环境意义。

目前，用于检测拟除虫菊酯类农药的方法有气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC），色谱和质谱的联用技术、毛细管电泳法等，但是这些仪器分析方法都需要经过繁琐的样品制备过程，而这些前处理过程不仅耗时费钱，而且可能会造成痕量拟除虫菊酯类农药丢失；而酶联免疫检测技术和免疫层析试纸条方法相结合，正好可以弥补这些方法的不足。

近年来，检测拟除虫菊酯类农药多残留的酶联免疫分析法已经建立，但是酶联免疫分析试剂盒的测定时间长，需要酶标仪读数，不适合现场的快速检测。而胶体金免疫层析试纸条用于检测样品时，结果可以用肉眼直接观察，成本低、时间短，特别适合于现场粗测。而在制备拟除虫菊酯类农药金标试纸条过程中，若包被抗原对相应单克隆抗体的亲和力过高，导致抗体的灵敏度下降；反之，若包被抗原对相应单克隆抗体的亲和力太低，导致检测线不显色。因此，只有在包被抗原对相应抗体的亲和力合适时，才能进行胶体金免疫层析试纸条的制备。

本发明设计并合成了一种新型的拟除虫菊酯类农药的通用包被半抗原，利用重氮化法偶联载体蛋白BSA，合成包被原，将其用于免疫分析和制备胶体金免疫层析试纸条，取得了很好的效果。目前，尚没有报道关于该包被原的制备以及将其用于拟除虫菊酯类农药的胶体金免疫层析试纸条的制备。

发明内容

本发明目的提供了一种拟除虫菊酯类农药通用包被抗原的合成及应用。合成的抗原采用紫外分光光度法进行鉴定，将该包被抗原用于拟除虫菊酯类农药的免疫分析和胶体金免疫层析试纸条的制备，为今后快速检测拟除虫菊酯类农药提供了有利条件。

本发明的技术方案：一种拟除虫菊酯类农药通用包被抗原的合成方法，以3-苯氧苯甲酸和对硝基苯丙氨酸为原料，经过2步化学反应，得到拟除虫菊酯类农药的通用半抗原，用重氮化法将其与载体蛋白BSA偶联，用紫外分光光度法来鉴定和估算偶联物的偶联比。其反应方程式为

（1）半抗原的合成。

①化合物3：N-(3-苯氧基苯酰)-4-硝基-L-苯丙氨酸的合成：

该反应在N₂保护下，将500mg化合物1：3-苯氧苯甲酸溶于10mL氯仿中，溶解后将其置于冰浴中，然后向其中滴加5μL的DMF和0.33mL氯化亚砜，搅拌5min后撤掉冰浴，然后在65℃油浴中加热1h，旋转蒸发除去氯仿及多余的氯化亚砜，得到无色透明的液体，加入1mL四氢呋喃将其溶解，为a液；接着将480mg化合物2：对硝基苯丙氨酸和380mg碳酸钾溶于10mL水中，为b液；然后在10min内将a液缓慢滴加到强力搅拌下的b液中，反应1h后，用每次50mL乙酸乙酯萃取两次，接着用每次30mL质量浓度0.8% NaCl盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，过滤旋干得到0.5g黄色胶状化合物3，直接用于下步，该产物的结构通过液质联用技术得到证实：LCMS(ESI)m/z=407.35([M-H]-)；

②化合物4：N-(3-苯氧基苯酰)-4-氨基-L-苯丙氨酸的合成：