[发明专利]一种采用消化法消化提取细胞流式检测组织内细胞凋亡率的方法

说明书

技术领域

本发明属于基础医学，涉及细胞凋亡检测方法，具体涉及一种采用消化法消化提取细胞流式检测组织内细胞凋亡率的方法。

背景技术

细胞的凋亡(Apoptosis)[Kerr JF,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.Br J Cancer,1972,26:239–257.]，又称程序性细胞死亡(Programmed cell death,PCD)，广泛发生于机体各种器官。细胞的凋亡对组织、器官的衰老、退变及更新具有重要的作用。目前研究发现，细胞凋亡与人类老年痴呆症[Anderson AJ,Su JH,Cotman CW.DNA damage and apoptosis in Alzheimer’s disease:colocalization with c-Jun immunore activity,relationship to brain area,and effect of postmortem delay.J Neurosci,1996,16:1710–1719.]，[Smale G,Nichols NR,Brady DR,Finch CE,Horton WE Jr.Evidence for apoptotic cell death in Alzheimer’s disease.Exp Neurol,1995,133:225–230.]、老年性白内障[Charakidas A,Kalogeraki A,Tsilimbaris M,Koukoulomatis P,Brouzas D,Delides G.Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract.Eur J Ophthal-mol,2005,15:213–220]、骨关节炎[Heraud F,Heraud A,Harmand MF.Apoptosis in normal and osteoarthritic human articular cartilage.Ann Rheum Dis,2005,59:959–965.]及椎间盘退变[Wang HQ,Yu XD,Liu ZH,Cheng X,Samartzis D,Jia LT,Wu SX,Huang J,Chen J,Luo ZJ:Deregulated miR-155promotes Fas-mediated apoptosis in human intervertebral disc degeneration by targeting FADD and caspase-3.The Journal of pathology,2011,225(2):232-242.]等疾病密切相关。然而对于组织，尤其是人椎间盘髓核这类细胞少，而细胞外基质丰富的结缔组织，目前常用的检测凋亡方法为Tunel染色法，这种方法灵敏度低，准确性差，且最终凋亡细胞比例需在显微视野下计数统计，可靠性低，数据受人为影响较大。

流式细胞仪(Flow cytometer,FCM)，是将流体喷射技术、激光技术、空气技术、γ射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非常先进的检测仪器。可检测细胞散射光和标记荧光强度，从而快速分析颗粒的物理或化学性质，同时对细胞进行分类收集，可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个细胞特征参数，进行定性或定量分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点。

细胞凋亡发生后，细胞膜，细胞核及细胞微结构出现一系列特定的生物学变化。可以采用常见的试剂Annexin V与Propidium Iodide(PI)在流式细胞仪的检测下分析组织细胞的凋亡比率。

Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合，是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。