[发明专利]一种海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的方法

权利要求书

1.一种瑞士乳杆菌蛋白酶的固定方法，其特征是，瑞士乳杆菌经过液体培养后得到发酵液，发酵液离心分离得到菌体，将菌体悬浮于Tris-HCl缓冲液中进行超声波破碎，破碎液离心后取上清液即为瑞士乳杆菌蛋白酶液；在蛋白含量为4 mg/mL～12 mg/mL的瑞士乳杆菌蛋白酶液中加入海藻酸钠，海藻酸钠的终质量浓度为1.5 %～2.0 %,混匀后用注射器滴入氯化钙溶液中，固化洗涤后加入戊二醛溶液交联，再洗涤沥干，即得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。

2. 根据权利要求1所述的海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的方法，其特征是固定化步骤如下：在瑞士乳杆菌蛋白酶液中加入海藻酸钠，37℃水浴搅拌混匀；用注射器吸取混合液，滴入0.1 mol/L的氯化钙溶液中，立即成球；4℃条件下静置4h，用蒸馏水洗涤小球后加入0.2%～0.8%的戊二醛溶液交联6h；洗涤沥干，得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。

3. 根据权利要求2所述的海藻酸钠-戊二醛协同固定瑞士乳杆菌蛋白酶的方法，其特征在于包括下列步骤：

（1）瑞士乳杆菌菌体的制备:将-80℃冷藏的瑞士乳杆菌冻干粉接种于MRS液体培养基，连续活化3代，在37℃下扩大培养至生长对数期取出；4℃，4500r/min，离心20min，收集菌体；用50mmol/L、pH 7.1Tris-HCl缓冲液洗涤菌体，混匀后在4℃，4500r/min，离心20min，收集菌体，菌体重复洗涤3次，冷藏备用；

（2）瑞士乳杆菌蛋白酶的制备：用pH 7.8 Tris-HCl缓冲液悬浮瑞士乳杆菌菌体，搅匀后进行超声波破碎，超声破破碎功率为300W，破碎时间3s，间隔时间5s，共破碎200次；4℃，4500r/min，离心20 min后取上清液即为瑞士乳杆菌蛋白酶液，-80℃冷冻保藏备用；

（3）瑞士乳杆菌蛋白酶的固定：在30mL瑞士乳杆菌蛋白酶液中加入0.6g海藻酸钠，37℃水浴搅拌混，4℃条件下静置备用；用10mL注射器吸取混合液，以15cm左右高度滴入0.1mol/L的氯化钙溶液中，立即成球；4℃条件下静置4h，用蒸馏水洗涤小球后加入0.4%的戊二醛溶液交联6h，洗涤沥干，得到固定化瑞士乳杆菌蛋白酶。