[发明专利]重组Tβ4-BP5融合肽、基因、工程菌及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种胸腺素β4与法氏囊五肽BP5重组融合肽，同时还涉及编码该重组融合肽的基因，表达该融合肽的工程菌及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

胸腺是免疫系统中重要的中枢免疫器官，负责细胞的分化和成熟，胸腺素是胸腺分泌的具有生物活性的多种多肽类物质的统称，亦称胸腺肽。胸腺素β4（Tβ4）是20世纪80年代从胸腺中分离得到、后来发现在许多组织中都广泛存在的一种小肽类物质。胸腺素β4是一种重要的肌动蛋白结合蛋白，含有43个氨基酸，分子量约5kD，等电点为5.1，其氨基酸序列如下：

Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser

胸腺素β4作为一种小肽类物质，不但在胸腺依赖性淋巴细胞的调节与分化方面具有重要功能，可显著增强胸腺细胞、骨髓细胞末端核苷酰转移酶活性，抑制巨噬细胞游走活性，胸腺素β4还可刺激下丘脑促黄体激素释放激素以及黄体激素的分泌，诱导T细胞系分型转变，在CD4细胞增殖抑制时激活CD8细胞。

法氏囊（bursa of Fabricus，BF）是禽类独有的中枢免疫器官，其功能类似于哺乳动物中的骨髓。法氏囊超滤物（1KD以下）中含有许多生物活性物质，特别是一些小肽对禽类具有免疫调节功能，能促进禽类、哺乳动物细胞的分化发育，促进免疫器官的成熟。其中的法氏囊活性五肽（BP5）是法氏囊中新分离出来的一种新的活性小肽，其氨基酸结构序列为：Cys-Lys-Asp-Val-Tyr。研究发现，BP5可以促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，不但具有提高机体体液免疫和细胞免疫功能，还具有平衡Th1和Th2类型免疫反应的功能。而法氏囊活性五肽的免疫平衡作用是一般免疫增强剂所不具备的。

由于法氏囊五肽BP5只能从鸡的法氏囊组织中提取，胸腺素β4从胸腺组织中提取，来源受到很大的限制，而且其它杂蛋白含量高，纯化难度大，其实际效果也受到很大程度的影响。而化学合成的胸腺素β4或法氏囊活性五肽成本高，不适合田间推广。

发明内容

本发明的目的是提供重组Tβ4-BP5融合肽。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供重组Tβ4-BP5融合肽，该融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明的目的还在于提供一种重组Tβ4-BP5融合肽的基因。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种重组Tβ4-BP5融合肽的基因，该融合肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；该融合肽基因由胸腺素β4基因和法氏囊五肽BP5基因通过柔性连接肽Linker基因串联而成，并在5’端加有肠激酶识别位点基因序列。

本发明的目的还在于提供一种重组Tβ4-BP5融合肽的工程菌。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种重组Tβ4-BP5融合肽的工程菌，该工程菌的构建方法包括以下步骤：

1）重组Tβ4-BP5融合肽基因SOE-PCR扩增

根据猪大肠杆菌偏嗜密码子设计重组Tβ4-BP5融合肽基因，并针对该融合肽基因设计引物F₁、F₂和F₃，然后进行SOE-PCR扩增；将PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带进行回收，回收产物中片段大小为159bp的为重组Tβ4-BP5融合肽基因；

2）携带重组Tβ4-BP5融合肽基因的工程菌的构建

将重组Tβ4-BP5融合肽基因和质粒载体pET32a用EcoRI、XbaI双酶切，并将酶切的重组Tβ4-BP5融合肽基因和质粒载体pET32a连接，连接产物转化E.coli DH5α；提取质粒，并将重组表达质粒进行HindIII缺失酶鉴定；酶切鉴定为阳性的质粒测序，命名为pET32a-Tβ4-BP5；将重组质粒pET32a-Tβ4-BP5转化进入大肠杆菌BL21中，筛选阳性克隆，即为表达重组Tβ4-BP5融合肽的工程菌。

所述引物

F₁：5’-CCGGAATTCACTGACAAACCTGACATGGCCGAGATCGAGAAATTCGACAAATCGAAGCTCAAGAAGACTGA-3’；