[发明专利]用于重金属铅的快速检测的核酸荧光探针及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种食品安全技术领域的方法，具体是一种采用荧光能量共振现象监测重金属离子作为辅助因子使核酸分子发生水解反应后的结构变化而用于定性定量检测金属离子的方法，适用于有害重金属快速检测研究。

背景技术

重金属铅污染具有隐蔽性、表聚性与不可逆性等特点，不仅影响农作物的生长发育、产量、品质等，而且通过食物链对人体健康造成严重的危害，尤其是最近一段时间，我国相继发生了几起与重金属铅污染相关的公共卫生事件，让人们对环境铅污染更加关注。铅的传统的检测技术要么费时费力，要么价格昂贵，都难以满足环境与食品安全监控的需求，因此，建立方便、快速的重金属检测技术十分必要。核酸分析方法用于病原检测的已经比较多，但是将其用于环境污染物检测方面的研究还不多见。本研究中所用的核酸—8-17脱氧核酶（DNAzyme8-17）是一种反式寡核苷酸，一个单链的DNA片段、非蛋白质、非生物体组成成分，具有分子量小，稳定性高，易人工合成，与其靶RNA配对的精确性高，但是需要特定的金属离子作为辅助因子才能发生水解。经研究发现在铅离子是使DNAzyme8-17发生水解的辅助因子，而其他的金属离子则使DNAzyme8-17的双链结构产生折叠，用荧光基团DNAzyme8-17，根据荧光基团的荧光变化来反应核酸的结构变化情况，用来检测铅离子。

经过对现有技术的检索发现，戢太云 徐鲁荣 周培在《核酸荧光探针检测铅离子的研究》（核酸荧光探针检测铅离子的研究，2010年1期）中公开了一种方法，将8-17DNAzyme增加2个G-C碱基对进行增强热稳定性的结构修饰,并标记上1个荧光基团FAM和2个荧光猝灭基团Dabcyl,设计成双猝灭Pb²⁺荧光探针.研究了该探针对Cd²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Pb²⁺6种二价金属离子的响应,结果表明探针对Pb²⁺具有很强的特异性,在探针浓度为2.5×10^-7mol/L时,Pb²⁺浓度在8.5×10^-8～7.5×10^-6mol/L范围内和探针的荧光强度呈线性关系,检出限为8.5×10^-8mol/L.该探针可用于Pb²⁺的定性和定量检测。但该探针的稳定性无法达到现有检出要求。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种用于重金属铅的快速检测的核酸荧光探针及其检测方法，将核酸分析法结合发光方法，用于重金属铅的检测。其检测过程简单快速，为是否需要进行后续的精准检测提供依据，为加强我国环境和食品安全控制和监督提供技术支撑。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种用于重金属铅的快速检测的核酸荧光探针，即DNAzyme8-17荧光探针，其DNA序列由以下：

A)5'-FAM-GCACTCACTATrAGGAAGA(-Dabcy1)GATG-3'，以及

B)3′-Dabcy1---CGTGAGTGATA(AAGCTGGCCGAGCC)TCTTCTCTAC-5'所组成。

本发明涉及上述探针的制取方法，通过用DNA/RNA合成仪分别合成设计好荧光标记位置的DNAzyme8-17底物链和酶链，将酶：底物：水=1:1:78的体积比配成的混合液置于PCR仪中95℃退火15min，非变性凝胶电泳分离纯化，切下双链条带，氯化钠溶解后过ZipTipC₁₈微量层析柱回收双链产物，得到双链荧光探针。

本发明涉及一种基于上述探针的重金属铅快速定性检测方法，通过对比探针中加入其它五种金属离子Zn²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺在260nm处的荧光强度，得到所述探针对于铅离子的特异性结果，并通过荧光强度变化实现Pb²⁺的定性检测。