[发明专利]重组人胰岛素原的复性与纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用高效体积排阻色谱(HPSEC或SEC)法复性与纯化重组人胰岛素原的方法，属于生物医药中变性蛋白复性技术领域。

背景技术

胰岛素原（Proinsulin，PI）是由86个氨基酸组成的单链肽，其C肽的两端各自通过两个碱性氨基酸残基与胰岛素A链的N末端和B链的C末端相连。胰岛素原分子的折叠卷曲保证了三对二硫键的正确对接。在胰岛素制备中，采用胰岛素原法直接酶切后获得有活性的胰岛素已经是一种成熟的方法。因此，获得高质量回收率的具有活性重组人胰岛素原（简称：rhPI）是制备重组人胰岛素的前提。

Robert B. M等[Robert B. M, et al, Protein Expres Purif, 1999, 15: 308-313]曾利用离子交换色谱（IEC）法和亲和色谱（AFC）法对rhPI包涵体蛋白进行纯化，之后用稀释法复性、酶切获得产物用RPLC法分析。而 Gusarova V等[Gusarova V, et al, J Chromatogr A. 2007, 1176: 157-162]报道了先利用稀释法复性rhPI，再分别用IEC法和SEC法进行两步纯化后，通过酶切转换为胰岛素。上述方法均利用稀释法复性，难于大规模进行蛋白药物的制备。

发明内容

本发明的目的在于提供的一种高效、快速的复性与纯化重组人胰岛素原的方法，能够提高重组人胰岛素原的质量回收率和纯度，并可直接用于酶切为胰岛素，适用于胰岛素的规模化生产。

本发明实现过程如下：

重组人胰岛素原的复性与纯化方法，包括以下步骤：

（1）在大肠杆菌（E.coli）中表达的重组人胰岛素原（rhPI）的菌体细胞经离心、超声破碎后分别用缓冲液I和II洗涤、离心溶解于强变性缓冲液中得到含有重组人胰岛素原的变性抽提液；

所述缓冲液I为10～20 mmol/L PBS，0.5～1 mmol/L EDTA，pH 7.0～7.5；

所述缓冲液II为0.5～2.0 mol/L脲，0.5～1 mmol/L EDTA，0.5～1.0 mol/L NaCl，10～20 mmol/L PBS，pH 7.0～7.5；

所述的强变性缓冲液为6.0～8.0 mol/L脲，10～20 mmol/LDTT，0.5～1 mmol/LEDTA，pH7.0～8.0；或6～7 mol/L盐酸胍，10～20mmol/LDTT，0.5～1mmol/LEDTA，pH7.0～8.0；

（2）将含有重组人胰岛素原的变性抽提液直接进样到流动相A（20～40 mmol/LPBS，0～8.0 mol/L脲，pH6.0～7.0）平衡的色谱柱，然后用含20～40 mmol/LPBS，pH6.0～7.0的流动相B线性梯度洗脱，流速为0.3～0.7mL/min，收集目标峰色谱馏分得到复性与纯化含重组人胰岛素原的色谱馏分；

（3）将步骤（2）含人胰岛素原的色谱馏分直接进样，用0～10  mmol/LPBS，pH6.0～7.0的流动相平衡的色谱柱进一步脱盐，持续洗脱20～40 min，流速0.5～1 mL/min，得到重组人胰岛素原。

上述步骤（2）中色谱柱为TSK gel G2000SWXL型（7.8mm×300mm）或Superde×200 10/300GL型（10 mm×300 mm）。

上述步骤（2）中所述洗脱方式可以采用流动相A平衡后，用流动相B线性梯度洗脱20～40 min，延长5～10 min。

上述步骤（3）中所述色谱柱为HiTrap Desalting column。

本发明的优点：本发明提供的利用脲浓度梯度体积排阻色谱对重组人胰岛素原复性与纯化的方法，解决了蛋白分子直接从高浓度变性剂扩散到与流动相中，而不能提供一个缓和的蛋白再折叠环境的问题，同时也克服了其他色谱方法成本高，难于放大的缺点。本发明在流动相中添加了小分子脲之后，在洗脱过程中，为蛋白再折叠提供了一个温和的环境，促进蛋白折叠成紧密的结构，保留时间延长，复性效率和质量回收率也得到提高。并且经过脱盐柱后更加利于后续酶切而得到胰岛素，操作简单成熟、稳定，固定相成本较低，易于控制和放大

附图说明

图1 复性与纯化前后rhPI的SDS-PAGE分析