[发明专利]一种小鼠毛囊干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种小鼠毛囊干细胞向原始生殖细胞分化的技术方法，特别是涉及一种将小鼠毛囊干细胞采用体外培养方式，经过形成拟胚体（EB）进行诱导，然后以小鼠成纤维细胞为饲养层采用共培养方式诱导形成原始生殖细胞的方法。属于生殖医学的生物医学技术领域。 

背景技术：

从2003年开始，多个实验组报导了他们将哺乳类干细胞，包括人类干细胞，诱导为各发育阶段的生殖细胞。在以雄性配子为目标的报导中，2003年Toyooka等首先以Vasa基因为PGC报告系统(reporter system)及BMP4为诱导因子，将小鼠干细胞诱导为PGCs（原始生殖细胞primordial germ cells）；并接着将分离出来的PGCs与睾丸细胞混合后移植到睾丸中产生精子。2004年，Geijsen等利用SSEA1为早期生殖细胞表面标记，加上RA(retinoic acids)诱导小鼠干细胞，成功在体外获得单倍体，並将其注射入小鼠卵子中，受精卵发育至囊胚期。德国研究小组Nayernia等同样利用RA诱导小鼠干细胞，并以Stra8及Prm1为报告系统，获得的类精细胞在注射入卵子后能获得后代。此外，Nayernia等人也用小鼠骨髓干细胞在体外转分化出了原始生殖细胞以及精原细胞样的细胞。2009年，我国研究小组Yu等报导成功将小鼠干细胞诱导为精子。这项研究值得关注的是首次将高表达DAZL基因做为诱导配子的方案。2011年日本Hayashi等利用小鼠胚胎干细胞，加上BMP4等诱导因子，分离出PGCs。在移植到睾丸后，获得成熟精子，并获得下一代小鼠。 

综合最近研究进展，大都采用胚胎干细胞（ESC）作为原材料，但是ESC处在哺乳动物个体发育的早期，而且取材困难，因此采用成体干细胞代替ESC向生殖细胞分化可以更好地解决问题。毛囊干细胞是一类具有自我更新能力及多向分化潜能的多能成体干细胞。 

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种小鼠毛囊干细胞体外向原始生殖细胞分化的技术方法。本发明方法分离出生后7天小鼠触须部毛囊，体外培养毛囊干细胞，将传代两次的毛囊干细胞体外培养形成拟胚体（EB）；然后以小鼠成纤维细胞（MEF）为饲养层，采用共培养的方式分化发育形成原始生殖细胞样细胞，并具有与体内正常发育的原始生殖细胞相类似的形态和特异基因表达特征。