[发明专利]OB-FOLD作为支架用于工程化新的特异性结合物

说明书

本申请是申请日为2007年12月04日的申请号为200780050902.4标题为“OB-FOLD作为支架用于工程化新的特异性结合物”的申请的分案申请

本发明属于蛋白质工程领域。特别地，本发明提供了用于获得特异性结合选自大量配体家族的靶的稳定分子的手段。

大多数天然蛋白质不适于治疗或甚至生物技术应用。蛋白质工程的挑战是限定有效和广泛的设计新的或改良的具有所需特性的蛋白质的方法。在靶定特性中，高特异性和亲和性识别配体是非常重要的。对于许多应用，抗体已被使用，这是由于它们特别适合于结合不同种类的配体如蛋白质，肽，核酸，糖等。但是由于分子复杂性和/或稳定性不足，通常抗体或它们的衍生物片段制备困难且昂贵。由于这些原因，最近已发展了使用经组合突变/选择方法工程化的支架蛋白质替代抗体的方法。目的是当去除抗体的缺陷时维持它们的有利特性。已报道该策略的成功应用(Binz et al.,2005;Mathonet and Fastrez,2004)，其中绝大多数的靶是蛋白质和特别地小有机化合物。

本发明的目的是提供用于工程化能很好适用于医学或生物技术应用和能够与多种靶特异性和高亲和力结合的分子的工具，所述靶选自核酸，蛋白质，碳水化合物或任何其他生物学分子。为此，本发明检验假设，即命名为寡核苷酸/寡糖结合折叠区(OB-fold)的一个特殊蛋白质结构可通过其结合面的残基的随机化而修饰，同时至少部分保留亲代蛋白质的有利生物物理学特性(即高稳定性和折叠效率)。

由Murzin(Murzin,1993)首先描述的寡核苷酸/寡糖结合折叠区(OB-fold)在所有界中发现并在20个染色体调查中排名为第28个最具代表性的折叠(Qian et al.,2001)。这个折叠，顶上带有一个两性分子α-螺旋的5链β-桶，似乎适于多种序列。OB-fold呈现一个β-折叠结合面，其在可被识别的化合物类型上赋予显著的多样性，所述化合物是ssDNA、dsDNA、RNA、寡糖、蛋白质、金属离子和催化底物。来自不同蛋白质的几个OB-fold的研究显示结合核心总是位于结合面的相同位置(Arcus,2002)。

Sac7d具有OB-fold拓扑结构(图1a)(Agback et al.,1998;Gao et al.,1998;Robinson et al.,1998;Su et al.,2000)。它属于来自超嗜热古细菌嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）的一类小染色体蛋白质。当在DNA中诱导尖锐扭结（sharp kink）时，Sac7d结合双链DNA，不具有任何特定序列优选性(Robinson et al.,1998)。认为在热硫化叶菌高生长温度时在DNA螺旋稳定化上发挥作用。（最佳为85℃）。Sac7d非常稳定。它耐热并在T_m91℃解折叠，在PH0到10之间保持天然折叠，当变性剂中点浓度2.8M时，盐酸胍诱导的变性可逆性发生(McCrary et al.,1996)。与抗体相反，它的分子组织非常简单。Sac7d是66个氨基酸、只有一个结构域(即OB-fold)和不具有二硫键的小单体蛋白质(McAfee et al.,1995)。已经发现Sac7d的几个截短形式(McAfee et al.,1995)。培养瓶培养大肠杆菌可实现过度生产水平达到可溶性蛋白质10-15mg/l(Edmondson and Shriver,2001)。Sac7d和其来自硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus）的相近同系物Sso7d的结构研究显示两个蛋白质核心是重叠的并主要经由16个残基形成的扭曲区域结合DNA小沟(Agback et al.,1998;Gao et al.,1998;Robinson et al.,1998)。