[发明专利]农杆菌介导的侵染月季芽点转基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程中对植物进行转基因的方法，特别是涉及一种农杆菌介导的侵染月季芽点转基因的方法。

背景技术

将外源基因或者经过修饰后的内源基因转入植物体内以改变植物某一特性，是改善作物品质的重要途径。自1983年首次培育出世界第一个转基因植物--转基因烟草以来，科学家试图不同的转基因方法，将外源基因或经体外修饰后的内源基因导入植物，改良植物的性状，并探索出了多种植物转基因方法。基因导入植物的方法主要有两大类：根癌农杆菌介导的遗传转化和DNA直接导入的转化法，后者主要包括基因枪法、花粉管通道法、子房注射法、PEG法、电击法、阳离子转化法、超声波介导法等。

目前绝大部分的转基因木本植物都是通过农杆菌侵染来进行的，也有一些植物用基因枪法，还可以通过电击法 和PEG^[1-3]法用原生质体进行转化。从目前的研究来看，农杆菌介导的木本植物转基因技术更加成熟有效，还没有一个更好的直接转化的方法可以代替它。在进行农杆菌介导的转基因试验时，要根据植物种类来挑选不同的农杆菌 ，环境因子如温度、pH值也会对转化效率产生影响^[4]。采用一些特殊处理也会影响转化效率，Yu等发现将桔子的上胚轴径向切开，可以显著提高转化效率^[5]。

从细胞全能性的理论出发，所有外植体均可以作为受体进行转基因试验。目前应用较多的外植体有叶片、叶柄、上胚轴、下胚轴、子叶、胚、胚性愈伤组织、体细胞胚、原生质体等材料。Pythoud 等在1987详细研究了根癌农杆菌对针叶树细胞的侵染过程， 发现虽然被侵染部位不一定被诱导出明显的肿瘤，但Ti质粒上的部分DNA片断是可以转移到针叶树细胞中去^[6]。Pena等在2001年将LFY和AP1基因导入到枳橙中，缩短了植株的童期，促使植株提前开花，且这些性状在后代中也得到了稳定的表达。Costa等在2002年成功将几种与类胡萝卜素合成有关的基因转入到柚子中，提高了转基因植株胡萝卜素的表达水平。2005年叶霞等获得了转铁结合蛋白(Ferritin)基因的苹果,该基因已经在植株叶片中得到表达^[7]。对柑橘的研究表明，相同条件下，未成熟外植体的转化效率要比成熟外植体的转化效率高。但如果选用未成熟的外植体，还需要等待相当长的时间才能开花结果，因此选用合适的外植体，提高成年外植体的转化效率或者缩短外植体的童期都是比较可行的方法。距今为止，有关月季转基因的报道还很少，目前只有日本学者在2007年利用月季茎尖分生组织为外植体通过农杆菌介导的植物转基因方法通过筛选成功的获得了开蓝色花的月季转基因植株^[8]，但是并没有详细介绍其转基因的过程。

由以上报道不难看出，木本植物尤其是月季转基因的完善的体系还没有完全建立，本专利所发明的这种月季茎尖生长点转基因方法克服了以前方法周期长、操作复杂、成本高的缺陷，优化了木本植物转基因过程，简化了木本植物转基因的操作，并探索出了木本植物基因高转化率的新途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的侵染月季芽点转基因的方法。将月季的枝条冲洗干净，经过消毒处理后剪成2~4cm的茎段，随后在超净台中将茎段形态学的下端插入MS固体培养基上。待茎段上长出芽点时，将其从茎段上切下，用刀片将芽点划伤，然后将其浸入农杆菌侵染液中，通过抽真空处理后，将浸染过农杆菌侵染液的芽点接种在MS固体培养基上进行共培养，共培养后再经过筛选得到转基因阳性植株，经过生根后将其移栽至温室，本发明避免了通过单细胞和愈伤组织的植株再生的繁杂过程，缩短了木本植物的童期，简便快捷，转化的后代可直接成株，克服了现有技术中工作量大、耗时长的植物组织培养过程。木本植物芽点转基因技术体系构建时间较现有技术显著缩短，转化效率也较高，不受季节影响，可应用于各种常见的木本植物，因此对木本植物遗传育种具有重大意义。

本发明提供的一种农杆菌介导的侵染月季芽点转基因的方法包括如下步骤：    

获得木本植物芽点转基因所需无菌茎段；将茎段接种至MS固体培养基使其长出芽点；将芽点从茎段上切下，并将其划伤；制备用于木本植物芽点转基因的农杆菌侵染液B；真空条件下用侵染液B侵染受伤的芽点；然后将侵染过根癌农杆菌侵染液B的芽点及根癌农杆菌共培养；将共培过的芽点接种在筛选培养基C上进行筛选培养；经过筛选后的生根苗移栽至温室中；对经过木本植物芽点转基因的木本植物植株做分子检测；具体步骤：