[发明专利]一株高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一株高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

β-葡聚糖酶是一类能降解谷物中β-葡聚糖的水解酶类的总称，主要包括4种酶，即内-β-1,3-葡聚糖酶、内-β-1,3-1,4-葡聚糖酶、外-β-1,3-葡聚糖酶和外-β-1,4-葡聚糖酶。作为一种特异性外源酶，β-葡聚糖酶被广泛应用于啤酒酿造工业和饲料工业中。β-葡聚糖酶可分解大麦及麦芽中β-葡聚糖凝胶，降低麦汁粘度，提高麦汁滤速及得率，有利于改善啤酒风味，保持成品酒非生物稳定性；将其添加于谷物类饲料可降低动物消化道内容物黏度，有效地改善单胃动物对营养物质的消化吸收，提高饲料转化率，还可减少排泄物对环境的污染，有利于环境控制和疫病防治。

β-葡聚糖酶的产生途径主要有两种。一种是在植物萌芽早期过程中产生。大麦等谷类种子发芽过程中产生β-葡聚糖酶催化水解胚乳细胞壁中的β-葡聚糖，解除其对胚乳中其它营养物质的抗性作用，β-葡聚糖酶可以降低浸提物的粘度，在催化时表现出对底物的β-糖苷键极强的专一性。另一种是在微生物发酵过程中产生。很多细菌、真菌和瘤胃微生物都可以产生β-葡聚糖酶，细菌中典型的产酶菌株有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amvloliquefaciens)等，真菌中有黑曲霉(Aspergillus niger)等。

目前国内外主要采用微生物发酵的方法生产β-葡聚糖酶。微生物的种类不同，其产酶活力也有差异，通常提高微生物酶活力水平主要通过采取物理与化学多次交叉诱变以及构造基因工程菌的方法来实现。贺小贤等(黑曲霉β-葡聚糖酶菌株诱变选育研究[J]．食品科技，2005(11).)以黑曲霉FHI为出发菌株，采用物理与化学相结合的方法，诱变选育出一株β-葡聚糖酶活性较高的菌株FHl2，酶活性较出发菌株提高2.23倍。韩晶等(高产嗜热β-葡聚糖酶菌种的诱变选育研究[J].酿酒科技.2009(8).)以嗜热β-葡聚糖酶产生菌枯草芽孢杆菌X-5为出发茵株，采用紫外线和硫酸二乙酯复合诱变处理技术，选育出一株产嗜热β-葡聚糖酶性能稳定、活力较高的突变株AS35，酶活性较原始出发茵株提高了81.54％。孙军涛等（β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆与序列分析[J].食品与生物技术学报.2011(30).）为了获得耐热的β-1,3-l,4-葡聚糖酶，利用PCR技术从解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中扩增β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)，构建重组表达质粒pET30a-bgl转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷酸(IPTG)诱导表达获得重组β-1,3-l,4-葡聚糖酶，并对纯化后的β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行酶学特性研究。

尽管如此，诱变育种因其盲目性、随机性，导致工作量巨大，筛选时间漫长，且菌株的突变还面临回复现象的难题。原生质体融合技术可以扮演类似于有性生殖途径基因信息交流的作用，可使遗传物质传递更为完整，重组机率更大，有利于提高育种速度。

目前，国际β-葡聚糖酶市场主要由几个酶制剂公司如丹麦NOVO、荷兰GIST、美国MILES等占有，并在中国市场占据着极大的份额，虽然我国国内针对β-葡聚糖酶开展了大量的相关研究，但因产酶菌株存在的酶活力不高，稳定性不强等原因，始终未能应用于大规模工业化生产，进口酶制剂垄断国内市场的局面始终未能打破。

发明内容

本发明提供了一种高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌，解决了传统产酶菌株的酶活力低、稳定性差的问题。

一种高产β-葡聚糖酶的菌株，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），完整命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）pj101，该菌株已于2012年11月28日保存在位于北京市朝阳区大屯路的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.6897。

本发明菌株属于硬（或厚）壁菌门，芽孢杆菌纲，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，单细胞，无荚膜，周生鞭毛，能运动，革兰氏阳性菌。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

本发明还提供了上述高产β-葡聚糖酶的枯草芽孢杆菌的诱变筛选方法，具体包括以下步骤：

(1)制备出发菌株的菌悬液；

(2)将出发菌株的菌悬液分别进行LiCl-紫外复合诱变和⁶⁰Co-γ射线诱变，获得诱变株；