[发明专利]一种提取哺乳动物和鸟类粪便DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从哺乳动物或鸟类粪便中提取并纯化总DNA的方法。

背景技术

近二十年，研究者广泛采用野生动物的粪便、毛发、唾液、尿液、食物残渣、卵壳、遗骸、博物馆标本等非损伤性样本获得目标物种的遗传物质，解决了许多传统采样技术难以解决的问题，促进了野生动物分子遗传学的研究。比较而言，采集野生动物的粪便具有采样方便、采样量大、不损伤动物且不受时空限制的特点，成为研究者最为青睐的采样途径。动物粪便内携带肠道脱落细胞，可用于提取目标动物的DNA。粪便成分十分复杂，还含有细菌、真菌、寄生虫、病毒及食物DNA，研究者必须通过设计特异的引物获取目标动物的DNA。然而，在提取粪便内目标动物的DNA时，会将酶、胆盐、胆红素、腐殖质和色素等PCR抑制物一同提取出来，这些PCR抑制物严重干扰后续的PCR反应，使得实验成本增加，试验周期拉长，甚至实验失败。这是令研究者最感棘手的问题。因此，通过粪便DNA途径进行任何动物的遗传分析时，研究者必须选择合适的粪便DNA提取方法。

迄今，国内外研究者发展了多种粪便DNA提取方法，提取原理包括：（1）硫氰酸胍（GuSCN）-二氧化硅（SiO₂）法；（2）十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法；（3）酚-氯仿法。但是，各种提取方法的通用性不好，存在物种差异，甚至同一物种不同个体间也存在差异。再者，还发现提取方法和保存方法存在交互作用，也就是保存方法不同，提取效果也发生变化。这严重阻碍了非损伤性的粪便DNA样本运用于动物保护遗传学研究。

发明内容

本项发明旨在提供一种简便、低廉且通用有效的从哺乳动物或鸟类粪便中提取并纯化总DNA的方法。该方法可有效的克服粪便中PCR抑制物的干扰，提取的DNA浓度和纯度可以达到进一步研究的需要。

本发明所提供的从哺乳动物或鸟类粪便中提取并纯化总DNA的方法，具体包括如下步骤：

（1）样品前处理：为如下A）或B）：

A）若待测粪便成形，则进行如下A1）或A2）

A1）若所述粪便体积大于等于1×1×1cm³，且所述粪便表面有明显粘液层，如普氏野马粪便，则取所述粘液层作为待测样品；

A2）若所述粪便体积小于1×1×1cm³，或所述粪便表面没有粘液层，如林麝粪便，则将所述粪便用液氮研磨，将研磨后样品作为待测样品；

在实际应用中，所述粪便表面没有粘液层包括粪便表面粘液层不明显的情况；

B）若待测粪便不成形，如鸟类粪便，具体如朱鹮粪便，则将所述粪便用液氮研磨，将研磨后样品作为待测样品；

（2）从步骤（1）所得待测样品中提取待纯化总DNA：为如下（a）-（d）：

（a）将所述待测样品置于pH8.0的缓冲液（如TNE缓冲液或PBS缓冲液）中，漩涡震荡2min，混匀后于56-60℃（如60℃）温浴8-12min（如10min）（期间上下颠倒混匀1次），漩涡震荡2min，使样品溶液更加均质化，从而得到样品混合液；

所述待测样品与所述pH8.0的缓冲液（TNE缓冲液或PBS缓冲液）的质量体积配比可为0.3g：1mL；

在本发明的一个实施例中，所述pH8.0的缓冲液具体为TNE缓冲液。

所述TNE缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：5mM Tris，16mM EDTA，100mM NaCl，pH8.0。

（b）将步骤（a）得到的样品混合液以500g离心5-10min（如5min），取上清液；

（c）除去步骤（b）得到的上清液中的蛋白，得到样品裂解液；

（d）对步骤（c）得到的样品裂解液进行DNA抽提和DNA沉淀，得到待纯化总DNA；

（3）对步骤（2）得到的待纯化总DNA进行纯化：为如下（I）-（II）：

（I）将步骤（2）得到的待纯化总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，切下含有所述待纯化总DNA的胶块，向所述胶块中加入溶胶液，于65-75℃（如70℃）溶胶，得到待过柱样品液；所述胶块与溶胶液的配比为1mg：3μl；

（II）将步骤（I）得到的待过柱样品液加入到硅胶膜DNA吸附柱内，进行DNA纯化，得到纯化后的总DNA样品。

在上述方法中，在步骤（2）（c）中，所述除去步骤（b）得到的上清液中的蛋白，具体可包括如下步骤：向步骤（2）（b）得到的上清液中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸钠（SDS），于54-58℃（如56℃）裂解1-1.5h（如1h）；