[发明专利]一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于固定化酶制备技术领域，特别涉及一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法。

背景技术

蛋白酶是一种具有特殊催化功能的高效生物催化剂，因其具有高选择性、催化反应条件温和、无污染等特点，该酶催化过程已经在工业中获得了较多的应用。但由于游离酶对工业催化过程存在一定的障碍，限制了其在工业上更广泛的应用，主要存在以下问题：(1)酶在脱离细胞内的环境后，往往很难保持长期的稳定性，容易失去活性，尤其在油相或油-水界面，更容易失去活性；(2)由于酶为水溶性，在水相中反应时难以回收利用，造成使用成本偏高；为了解决游离蛋白酶的缺陷，人们发明了酶固定化技术，即酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，使之仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。

在本发明之前，依据酶的性质及用途主要分为吸附法、共价结合法、包埋法和交联法几种。传统酶固定化方法还存在着一定的缺陷性：(1)固定化蛋白酶的载体制备和固定化过程分开进行，造成固定化过程复杂，酶与载体的生物相容性较差；(2)采用吸附交联法固定化的蛋白酶，其与载体之间的结合作用相对较弱，容易造成酶脱落，从而使得固定化酶的稳定性差，使用寿命低；(3)采用共价结合法固定化的蛋白酶，其固定化反应通常较剧烈，容易造成酶的失活，从而导致固定化酶的活力降低。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述缺陷，提供一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法。

本发明的技术方案是：

一种反应-吸附耦联固定化蛋白酶的制备方法，其主要技术特征在于包括以下步骤：在固定化反应器中加入聚苯胺单体和蒸馏水使得溶液浓度为0.01～0.2mol/L，用酸调节溶液pH为1.0～7.0；充分搅拌至溶液充分混合均匀后，在-10℃～45℃条件下恒温静置；再向固定化反应器中加入事先在-10℃～45℃条件下恒温的引发剂和助剂，引发剂与单体的摩尔浓度比为1∶0.3～1∶5，助剂和单体的摩尔浓度比为1∶1～1∶10，同时加入游离蛋白酶，单体质量与蛋白酶质量比为1∶0.01～1∶0.1；然后搅拌使整个体系混合均匀，放置于-10℃～45℃恒温条件下反应12～24h；反应结束后，分别用蒸馏水、无水乙醇过滤洗涤多次至滤液无色，然后将产物真空干燥或冷冻干燥8～24h，得到固定化酶。

用于固定化的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、组织蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、链霉菌蛋白酶、氨基肽酶、胶原酶。

上述的单体为苯胺及苯胺衍生物，即苯胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、邻苯二胺、邻氯苯胺、间氯苯胺、邻甲氧基苯胺、邻巯基苯胺中的一种。

上述用于调节单体溶液pH值的酸为无机酸，即盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、磷酸中的一种。

上述的引发剂为K₂Cr₂O₇、(NH₄)₂S₂O₈、Ce(SO₄)₂、FeCl₃、FeCl₄、AlCl₃、HAuCl₄、KIO₃、H₂O₂、MnO₂中的一种。

上述的助剂为F127(EO₇₀PO₁₀₀EO₇₀)、丁基萘磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、二甲基二烯丙基氯化铵中的一种。

上述的真空干燥温度为10℃～45℃，真空度为0～-0.1MPa。

本发明的优点和效果在于：制备载体的同时加入游离酶使得固定化过程简单，条件温和，时间缩短，生物相容性好，能耗降低；固定化酶的蛋白吸附量高，酶活力高；固定化的酶稳定性好，使用寿命长。

本发明方法制备固定化蛋白酶的工艺简单，载体价廉易得，成本较低，有利于大规模的工业化生产。

具体实施方式

以下将通过具体的实施例进一步阐述本说明，但本发明技术方案不局限于以下所列的具体实施方式。

所述的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、组织蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、链霉菌蛋白酶、氨基肽酶、胶原酶。