[发明专利]一种提高生物发光分析方法灵敏度的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学分析领域，更确切的说是一种新的提高荧光素酶生物化学分析灵敏度的方法。该发明也包含实施该生物化学分析方法所需的试剂包。

背景技术

微生物的检测无论是在临床检测还是在工业应用领域都具有重要的意义。当前，对微生物的检测主要采用传统的平板培养计数法，该方法需要较长的时间对微生物在一定条件下进行培养，然后进行平板计数获取微生物的浓度。该方法步骤繁琐、耗时长，很多时候难以满足现场快速检测的要求。ATP生物荧光检测法是近几年发展起来的一种新的微生物检测方法，它具有快速、准确、灵敏等诸多优点。

ATP(adenosine triphosphate，中文三磷酸腺苷)作为重要的能量分子存在于所有的生物体内，通过测定一定条件下ATP的数量，可以间接推断微生物的数量或浓度。ATP生物荧光检测法利用微生物细胞内的三磷酸腺苷(ATP)与荧光素-荧光素酶间的复杂生化反应，产生生物荧光，然后通过荧光测定仪或液闪测定仪测定荧光强度。在荧光素、荧光素酶、温度、pH等外界条件相同的情况下，上述荧光强度与ATP的数量成正比关系。

在进行上述生光反应以测试ATP的数量之前，首先需要通过一定的物理、化学手段打破细胞壁和细胞膜以释放ATP。但是，物理方法如机械挤压、煮沸、超声等方法繁琐，有时还较为昂贵，因此，通常采用化学手段释放ATP。常用的化学手段包括各种释放剂，如表面活性剂、酸、碱，甚至有机溶剂等。上述释放反应中的释放液除了满足对ATP释放的目的外，还应具有如下两种作用：一是应迅速钝化释放过程中细胞ATP分解酶，减少或消除其对ATP的分解作用；二是不能对后续生光反应中的荧光素酶带来不利影响。上述对释放液满足生物酶所具有的两种截然相反效果的要求导致对释放液的选择很难两全，通常是兼顾二者要求妥协后的成分，从而降低了生物发光检测的灵敏度。

迄今，已经提出了几种上述问题的解决方法。例如，常用的解决方法之一是对释放ATP后的溶液在反应前先稀释到一定浓度(如50倍稀释)，以降低释放剂的浓度，减轻释放液对荧光素酶的影响。但是，这种方法不能过分稀释，否则会减低ATP反应的检测灵敏度，导致两难。美国专利(U.S.Pat.No.5,558,986)采用环糊精解决释放剂对荧光素酶的抑制作用。环糊精具有锥形结构，外表面亲水而内表面憎水，通过将微生物破壁后的释放剂收容于环糊精的空腔，可以有效减轻后续生光过程中对荧光素酶的活性抑制作用。但是，环糊精自身价格较高，效果有限，且需要额外的加入环糊精步骤，较为繁琐。美国专利(U.S.Pat.No.7,829,280)采用不溶性树脂沉淀破壁后的释放剂以达到减低释放液对荧光素酶抑制作用的目的。但是，该方法仍然需要额外的加入步骤，此外，还存在需要添加量大，成本高，操作不易等缺点。

因此，寻找一种更为简便易行、有效的兼顾ATPase抑制和荧光素酶保护的方法，将对生物发光分析方法的提高和推广具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有ATP生物荧光检测中细胞释放液即离子型表面活性剂对细胞释放过程中对三磷酸腺苷分解酶的抑制和生光过程中对荧光素酶的保护发光反应中荧光素酶活性抑制的问题，提供一种有效的兼顾二者要求的检测方法和检测用试剂盒。

本申请人发现，ATP释放用的离子表面活性剂(包括阳离子表面活性剂和阴离子表面活性剂)在过量的情况下形成胶束，可以与具有相反电荷的植物多糖衍生物形成单一相，其原理主要是通过表面活性剂与植物多糖衍生物憎水段的相互作用，达到植物多糖衍生物在表面活性剂胶束作用下溶解，从而形成均一相；上述均一相稀释到一定浓度下后，表面活性剂不能形成胶束，表面活性剂的亲水端(带有电荷)可以与植物多糖衍生物所具有的相反电荷作用，导致絮凝，从而极大地减低溶液中表面活性剂的浓度。利用上述原理，在细胞释放段采用高浓度的表面活性剂，保证细胞释放过程中对ATP的有效释放和ATP分解酶的快速淬灭，细胞释放完毕后，对上述释放液进行稀释，利用多糖的离子电荷将表面活性剂絮凝减低其浓度，以极大降低表面活性剂对后续生光反应中荧光素酶的影响。上述方法可以极大地提高细胞样品荧光生物化学分析的检测灵敏度。

本发明提供的高灵敏度生物发光检测方法的检测步骤是：

1)制备细胞释放液，该释放液含有高浓度的离子表面活性剂和与表面活性剂具有相反电荷的离子植物多糖衍生物，获得第一种混合液；

2)混合第一种混合液与细胞样品，释放ATP，获得第二种混合液；

3)将第二种混合液稀释，直至出现絮凝，取上层清夜，获得第三种混合液；