[发明专利]新城疫病毒rNDV-H52AH9及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及应用反向遗传技术，拯救一株以新城疫病毒为载体共表达H5和H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组疫苗株rNDV-H₅2AH₉，用于研制疫苗。

背景技术

反向遗传操作技术(Reverse genetics manipulation technique)是指通过在体外构建RNA病毒的感染性分子克隆，将病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒的一项研究技术[ A,Mundt E,Mebatsion T,Buchholz UJ,Mettenleiter TC.Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA.J Gen Virol 1999.80(11):2987—95.]，也叫“病毒拯救”。由于最终“拯救”出的RNA病毒来源于cDNA克隆，因此，可通过中间过程中人为加入的DNA环节，在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工改造，解决了RNA病毒基因组难以操作这一难题，同时为新型疫苗的研制和开发提供了新的思路[Nakaya T,et al.Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector.Journal of Virology,2001.75(23):p.11868-73.]。

新城疫（ND）是危害养禽业的重要疫病之一，新城疫病毒（NDV）基因组全长约15kb，其结构为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein,NP）、磷蛋白（Phosphoprotein,P）、基质蛋白（Matrix protein,M）、融合蛋白（Fusion protein,F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuraminidase protein，HN）和大分子蛋白（Large protein,L）。从近十年来的ND流行特点来看，临床上所分离到的NDV毒株大多数属于基因VII型强毒株[Liu XF,Wan HQ,Ni XX,et al.Pathotypical and genotypical characterization of strain of Newcastle disease isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during1985-2001.Archives of Virology,2003,148(7):1387-1403.]，而常规的ND疫苗株的基因型主要为I和II型（如V4、LaSota等），在遗传距离上与当前分离株相差较远。

禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)属于正粘病毒科(Orthomyxovoridae)中的A型流感病毒属，病毒基因组由8个负链的单股RNA片段组成。该病毒感染禽类的症状从轻度上呼吸道感染、产蛋量降低，直至急性全身致死性疾病。基因组分为8个片段，是负义的单股RNA，片段1~8由大到小依次命名为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因。根据表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同划分亚型，迄今已发现了16种HA和9种NA亚型，HA蛋白是禽流感病毒的主要保护性抗原，它不仅诱导机体产生特异性抗体，而且诱导CTL反应。

目前H5N1亚型禽流感病毒在世界范围内对养禽业造成了巨大的损失，呈现高发病率和高死亡率，严重威胁着养禽业的健康发展，同时也威胁着人类的健康，是重要的人畜共患病病原。H9亚型禽流感病毒长期以来困扰养禽业发展，H9N2是目前亚洲的流行主型之一，广泛存在于家禽中，虽然表现低致病性，但由于传播广泛、能造成免疫抑制使宿主易发生继发感染、产蛋鸡的产蛋下降、发病率高，对养禽业造成了严重的危害，并具有重要的公共卫生意义。