[发明专利]一种产生物表面活性剂烃降解菌的分离筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种产表面活性剂的烃降解菌的分离筛选方法，属于环境生物工程和环境微生物领域。 

背景技术

随着石油的开采、运输和泄漏以及含油废水的排放，每年有800多万吨石油进入环境，污染土壤、地下水、河流和海洋，对生态环境造成了很大危害，影响生产和人民生活。因此，石油污染问题引起了人们越来越多的关注，对之进行治理也成为了最迫切的事情。 

石油污染环境的修复有物理、化学和生物修复等三种方法。微生物修复技术是生物修复中最重要、最核心的组成部分，具有成本低、应用方法简单、污染物氧化完全、无二次污染、可原位处理、不需大型设备等优点，日益引起重视。 

微生物修复的关键技术是选用高效的石油烃降解菌株。主要在被石油污染的水环境和土壤环境中采样后进行分离和筛选。虽然产表面活剂被认为是微生物乳化石油促进降解的机制之一，但筛选产表面活性剂的烃降解菌的方法尤其是高效初筛方法仍令研究者感到困难。因此，本发明结合发明人自身的研究体会，归纳并有所创新，提出了一套较简洁高效的产表面活性剂烃降解菌的分离和筛选方法。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种产表面活性剂的烃降解菌的分离 筛选方法，能够较快地分离与纯化到既产较高产量的表面活性剂，又有效去除石油烃污染的降解纯菌株。 

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下： 

具体方法步骤为： 

(1)取样：取原油污染地或加油站附近污染表层5-20cm深的土样，记录采集位置、土壤含水量、含油量等，进行编号； 

(2)富集培养：各土样按质量体积比5％加入含有原油的矿质盐培养基(MSM，加入原油作为唯一碳源后称烃降解培养基)中，原油含量分别0.5％、1.0％和1.5％，每个浓度在30℃条件下培养7天，之后转移至更高浓度原油的烃降解培养基中，直到含油1.5％的培养基培养完成，驯化结束，使能利用原油做单一碳源的微生物得到富集； 

矿质盐培养基按以下方法配制(/L)：MgSO₄0.2g，KH₂PO₄1.0g，(NH₄)₂SO₄1.0g，CaCl₂0.02g，K₂HPO₄1.0g，FeCl₃0.05g，蒸馏水1L，pH值最后调整为7.0-7.2，做发酵培养基时，事先在250mL三角瓶中加入一定量的原油，再加入50mL MSM，121℃灭菌20min备用。 

(3)血平板分离：取富集后的菌液，稀释至适宜倍数涂布于血平板上，30℃培养1-3天，直到有明显的溶血圈产生(见图1)，平板采用肉胨培养基中加入5-7％的脱纤维羊血获得。肉胨培养基成份为(/L)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，纯净水或自来水1L，调pH至7.0左右。配制血平板时要加1.5％的琼脂粉，灭菌后取出冷却至50℃左右时，加入5-7％的脱纤维无菌羊血，迅速分配至培养皿中，冷却后即得血平板，血平板不耐贮存，一般随用随配； 

(4)油平板分离：挑取血平板上产透明圈的菌株50个左右，肉胨培养基活化后接种于油平板上，用牙签钝头接种于油平板上，每个油平板接种4-5个菌株。 30℃条件下培养3天(见图2)； 

油平板配制方法如下：将原油溶于浓度10％的石油醚中，滤纸剪成直径85mm，置90mm培养皿中，加2mL10％石油溶液，待石油醚挥发后，121℃蒸汽高压灭菌20min，取出烘干备用。MSM中事先加入1.5％的琼脂粉，灭菌后倾倒平板，平板尚未凝固时将滤纸紧贴在平板上后即成油平板。 

(5)菌种保存、编号：挑取油平板产噬油斑的菌落接种于斜面中30℃培养1-2天长出菌苔后，置4℃备用； 

(6)烃降解能力摇瓶鉴定和筛选：取平板初筛出来的菌株，用液体肉胨培养基(肉汤培养基)做种子培养后接于含原油1％的烃降解培养基中，30℃摇床培养7d，观察原油乳化和降解情况，挑取原油乳化或降解明显的摇瓶(见图3)，测定残余烃的量和发酵液离心后的上清液的表面张力，测定残余烃的量和发酵液离心后的上清液的表面张力。测定残余烃的量采用重量法，测定表面张力采用表面张力仪进行(见图4)；