[发明专利]小鼠抗人CK19单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株

说明书

技术领域

本发明涉及以原核表达的CK19蛋白免疫小鼠获得的分泌CK19单克隆抗体的杂交瘤细胞株11F5，属于生物工程技术领域。 

背景技术

CK即细胞角蛋白(Cytokeratin)，是细胞骨架蛋白之一中间丝多基因家族中的一种，为上皮细胞主要的结构蛋白和分化的早期标志物。细胞角蛋白由30种不同的基因编码，这些基因可以转录成分子量不同的20种多肽，分别命名为CK1～CK20。细胞角蛋白又可根据等电点的不同分为酸性(I类)蛋白，包括CK9～CK20；及碱性(II类)蛋白，包括CK1～CK8。一般而言，相对分子质量小的细胞角蛋白总是与大的细胞角蛋白配对，而酸性细胞角蛋白总是与碱性细胞角蛋白配对。细胞分化的不同阶段及不同类型上皮细胞表达不同的细胞角蛋白。 

CK19属于酸性(I类)细胞角蛋白，分子量约40kDa，是相对分子质量最小的细胞角蛋白，存在于正常上皮和各种上皮来源的肿瘤中，特别是单层上皮细胞和间皮；在肝细胞和角膜为阴性表达，在子宫上皮、羊膜的上皮和间质中呈阳性表达。 

CK19在肝细胞中不表达但存在于胆管上皮和胆管癌，由于这一特性，CK19是目前诊断肝内胆管细胞癌(ICC)的主要免疫组化标志物。作为上皮源性细胞特异性标志基因，CK19也是早期癌症微转移研究中运用最多的分子标志之一，主要用于腺癌的诊断以及转移性腺癌和肝癌的鉴别诊断。 

目前，国内外已经获得了多种CK19的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的CK19的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测CK19表达的小鼠抗人CK19单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案： 

(1)根据CK19的基因序列(BC002539.2)的编码框，设计一对特异引物，Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增CK19基因，构建重组表达载体PET28a-CK19，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。 

(2)采用经典的细胞融合技术制备CK19单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白， SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。 

(3)通过免疫组织化学分析CK19单克隆抗体染色人甲状腺乳头状癌、结肠腺癌和肝脏胆管组织石蜡切片。 

(4)根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体CK19重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体CK19的重链和轻链可变区序列。 

本发明提供的以原核表达的CK19蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌CK19单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为11F5，分类命名为小鼠抗人CK19杂交瘤细胞系，该细胞株11F5已于2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.6913。 

本发明还提供了所述杂交瘤细胞株11F5，CGMCC No.6913产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：10。 

本发明还提供了一种DNA分子SEQ ID NO：7和DNA分子SEQ ID NO：8，DNA分子SEQ ID NO：7编码重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：9；DNA分子SEQ ID NO：8编码轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：10。 

本发明的优点和有益效果： 

本发明应用重组人的CK19蛋白为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，采用经典的细胞融合技术，通过ELISA筛选，获得一株能稳定分泌抗CK19的杂交瘤细胞株，命名为11F5，