[发明专利]一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备

说明书

技术领域

本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备。具体地，利用基因重组技术，将非洲猪瘟重要结构蛋白P72、P54以及红细胞凝集素HA多个T细胞表位和纯化标签串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵，纯化、乳化工艺制备，得到具有细胞免疫和体液免疫效果的非洲猪瘟蛋白工程疫苗，用于非洲猪瘟疫情的防控。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒ASFV引起的猪的一种急性、热性传染性疫病。国际兽医局将其列为A类动物疫病，我国已将此病规定为一类动物传染病。ASFV是一个复杂的二十面体病毒，其特征与虹彩病毒科和痘病毒科的成员相似。ASFV为双股线性DNA基因组，根据病毒株的不同其大小为170～190 kb（Blasco等，1989；Tabares等，1980）。ASFV是一种非常复杂的病毒，基因组共有150多个开放阅读框，共编码100多种多肽，在不同的实验室所得到的结果有一定差异。ASFV病毒可以编码34种以上的结构蛋白，虽然病毒的结构蛋白很多，但是证实具有抗原性的蛋白仅有几种，Tabares(1980) 等发现6种，VP72，VP162，VP146，VP54，VP34，VP23.5，其中p72、p54、p30和p12，具有良好的抗原性。P72是一个主要的衣壳蛋白，占整个病毒粒子总蛋白的32%，国外研究表明，不同区域的ASFV 病毒诱导产生的P72抗体的相应抗原表位都相当保守，而且抗原性很稳定，常被用来作为血清学检测和免疫制剂。膜结构蛋白P54由D183L基因编码，含有一段跨膜区域，主要集中在衍生的内质网膜处，其与轻链细胞质动力蛋白DLC8存在特殊的交叉反应，并在细胞内摄作用及病毒加工过程中其重要作用。感染病毒后复制早期，病毒可激活细胞凋亡蛋白酶，诱发细胞脱噬作用。

ASFV有很好的抗原性，在感染期间能诱导产生高水平的特异性抗体。在感染后4d能检测到IgM，感染后6～8 d能检测到IgG (Sanchez- Vizcaíno等，1979)。并且初次感染后血清中的抗体能维持很长一段时间。抗ASFV的抗体能延迟临床症状的出现，减轻病毒血症，并能保护感染猪不会死亡(Onisk等，1994；Schlafer等，1984)。早期的实验表明实验感染和自然感染ASFV的猪血清中没有中和抗体。然而，康复猪用口蹄疫疫苗免疫时能产生正常水平的中和抗体，该实验证明了ASFV对体液免疫反应不存在负面影响(De Boer，1967)。其他学者(Ruiz Gonzalvo等，1986)也证明不同的ASFV分离株大部分能被恢复期血清中和，但总有10%的ASFV不能被中和。另外，Gomez-Puertas等(1996)报道，恢复期猪血清中的ASFV抗体能有效地中和感染易感细胞之前或之后的ASFV。然而，现在还不能证明ASFV的特异性抗体完全符合经典的病毒中和试验；另一方面，来自康复猪的细胞毒性T淋巴细胞能杀死感染ASFV的巨噬细胞(Martins和Leitao，1994)，这表明细胞介导的免疫反应可能是保护性免疫反应的重要组成部分。

尽管研究人员已经对ASFV 的生物学知识已经有了深入的了解，但目前还无法治疗ASF，也没有有效的疫苗来预防ASF。自从1963年第一个ASF弱毒疫苗在葡萄牙应用以来(Manso Ribeiro等，1963)，人们做了许多努力以期制备满意的疫苗。灭活疫苗不能产生任何保护作用。弱毒活疫苗能使一些猪免受同源ASFV毒株的感染，但是这些猪部分会成为病毒携带者或出现慢性病变，当大规模使用弱毒活疫苗时，这种可能性会增加(Manso Ribeiro 等，1963；Sanchez Botija，1963)。其他研究表明，抗同源或一些异源ASFV毒株的猪血清能抑制（体外）与异源毒株相关但与异源毒株不同的毒株对细胞的感染(Ruiz Gonzalvo等，1986)。近年来的发现表明，针对ASFV蛋白p30、p54和p72的中和抗体不足以产生抗体介导的免疫保护( Neilan 等，2004)。

以往的疫苗均是以灭活疫苗和弱毒疫苗为基础进行尝试，但效果均不理想。未来进一步开发以特异性靶向基因剔除（如编码入侵宿主防御系统的基因）为目标的安全性好和效力高的重组弱毒疫苗可能会产生较好的效果。尽管分子生物学技术已经成功应用于界定体内ASFV 相关毒力因子，但时至今日，由于其残余的毒力，仍没有证据表明合格的重组弱毒疫苗开发成功。研究人员（Jordi M. Argilaguet等，2012）基于成功诱导免疫反应抗原特性，开发了DNA 疫苗，但是免疫后仅能诱导部分保护。