[发明专利]一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法

权利要求书

1.一种杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）杂交鹅掌楸转化受体的建立：取继代2周的杂交鹅掌楸愈伤组织细胞，接入含有杂交鹅掌楸M13液体培养基的三角瓶中，23℃，95r/min的恒温摇床振荡培养；每7天继代一次，继代3次后建立出悬浮细胞系，即为杂交鹅掌楸转化受体；

（2）农杆菌制备：先活化EHA105单菌落，在含有卡那霉素50mg/L、链霉素30mg/L的LB液体培养基中，28℃，280r/min振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，4℃离心收集菌体，用杂交鹅掌楸M13液体继代培养基重悬菌体，将菌液浓度稀释至0.5左右；

（3）侵染：取3ml菌液加到杂交鹅掌楸转化受体中，并加入乙酰丁香酮100μmol/L；

静置1-3min后，置于23℃、95r/min的恒温摇床中，继续振荡培养16~40h；

（4）脱菌培养：将杂交鹅掌楸悬浮细胞经400目及150目的筛子过筛，用Z36杂交鹅掌楸单细胞培养基将400目的筛子上的单细胞悬浮，置于23℃、95r/min的恒温摇床，振荡培养36h后，再用400目的筛子过筛一次，并用加有头孢霉素500mg/L的Z36杂交鹅掌楸单细胞培养基将400目筛子上的单细胞收集；并将单细胞以2mL每皿的浓度铺平板，培养基加头孢霉素500mg/L，约21天继代一次；继代一次后，可以观察到子叶胚；

（5）筛选培养：待子叶胚成熟，长到2cm左右，将其挑出，转到MS基本培养基上生长，其中加有头孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。

2.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于：步骤（1）中，取继代2周的杂交鹅掌楸愈伤组织细胞5mL，将其接种到250mL的三角瓶中，并在瓶壁轻轻敲散；量取50mL杂交鹅掌楸M13液体培养基加入三角瓶中，将材料置于23℃，95r/min的恒温摇床振荡培养。

3.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于：步骤（2）中，农杆菌制备，具体操作为：

1）将-70℃保存的EHA105菌液在冰上融化，用接种环蘸取少量菌液，接种到含有卡那霉素50mg/L，链霉素30mg/L的LB培养基上，将其置于28℃恒温培养箱中培养；

2）待其长出单菌落后，用接种环挑取单菌落，接种到含有卡那霉素50mg/L，链霉素30mg/L的LB培养基上，再活化一次，然后将其置于28℃恒温培养箱中培养；

3）待其长出单菌落后，用灭过菌的枪头挑取单菌落接种到含有10mL加有卡那霉素50mg/L，链霉素30mg/L的LB液体培养基的三角瓶中，28℃、220r/min振荡培养；

4）约20h后，吸取2mL菌液，接种到含有50mL加有适量抗生素的LB液体培养基的三角瓶中，28℃、280r/min振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8；

5）待农杆菌培养到OD₆₀₀为0.6-0.8时，取25mL菌液于50mL离心管中，于5000r/min，4℃离心10min，去除上清，收集菌体；

6）用杂交鹅掌楸液体继代培养基重悬菌体，将菌液浓度稀释至OD₆₀₀为0.5。

4.根据权利要求1或3所述的杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于：所述的EHA105带有35S：GUS基因和NPT-Ⅱ基因。

5.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于：步骤（3）中，共培养36~40h。

6.根据权利要求1所述的杂交鹅掌楸高效遗传转化方法，其特征在于：步骤（5）中，每21天继代一次，继代2次后，就可用于移栽。